Что такое бумажная хроматография
Что такое хроматография? Типы и применения
Слово «хроматография» означает «цветное письмо», но оно является неправильным, потому что оно часто не включает бумагу, чернила, цвет или письмо.
Михаил Семёнович Цвет (1872-1919)— русский ботаник-физиолог и биохимик растений, создатель хроматографического метода.
M.С. Цвет использовал хроматографичекий метод для разделения пигментов растений. Для разделения хлорофиллов Цвет наполнял стеклянную трубку (колонку) твердым адсорбентом (например, инулином) и наносил на верхний слой экстракт хлорофиллов в лигроине. Затем промывал колонку лигроином. Цвет писал так – «Из нижнего конца воронки вытекает сначала бесцветная, потом желтая жидкость (каротин), в то время как в поверхностных слоях инулинового столба возникает интенсивное зеленое кольцо, на нижнем крае которого быстро образуется желтая кайма.
При последующем пропускании через инулиновый столб чистого лигроина, оба кольца, зеленое и желтое, значительно расширяются и распространяются вниз до известного предела». «Как цветные лучи солнечного спектра различные компоненты из смеси пигментов были выделены и могли анализироваться дальше количественно и качественно». 2 Результат разделения, а именно последовательность различных цветовых зон Цвет назвал – хроматограммой. Для разделения пигментов Цвет использовал более ста различных адсорбентов, детально отработал технику разделения и предложил различные варианты аппаратов для своего метода (хроматографов).
Последнее время появилось ряд сообщений авторитетных российских химиков о том, что практически параллельно с западными учеными первые работы в области аналитической газовой хроматографии выполнили в 1940-е г.г. советские исследователи М.М. Сенявин, Н.М. Тулькертауб, А.А. Жуховицкий и Д.А. Вяхирев. Это были работы по газо-адсорбционному разделению, выполненные задолго до широко известной публикации А. Джеймса и А. Мартина в 1952 г., от которой официально ведет отсчет история газовой хроматографии. 4
Метод хроматографии основан на динамическом процессе распределения веществ между двумя фазами — неподвижной (твёрдая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе) и подвижной (газовая или жидкая фаза, элюент). В зависимости от природы взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами и индивидуальных свойств, компоненты движутся с различной скоростью, что позволяет разделять их между собой.
Основные термины и понятия, относящиеся к хроматографии, а также области их применения были систематизированы и унифицированы специальной комиссией ИЮПАК. Согласно рекомендациям ИЮПАК, термин «хроматография» имеет три значения и используется для обозначения специального раздела химической науки, процесса, а также метода. 6
Существуют различные способы классификации хроматографических методов: по физическому состоянию подвижной фазы (газовая и жидкостная хроматографии), по технике выполнения хроматографического разделения (колоночная, плоскостная, хроматография в полях сил), по природе взаимодействия разделяемых компонентов с неподвижной фазой (адсорбционная, ионообменная, эксклюзионная и др.) и др.
Современная хроматография имеет много разновидностей, наиболее популярные их них, которые помогут вам получить более полное представление о процессе представлены ниже. Мы попытались объяснить их очень простым языком.
Основы хроматографии
По своей сути хроматография включает взаимодействие двух разных фаз. Химическое соединение в одном состоянии вещества (например, жидкость или газ) перемещается по поверхности другого вещества в другом состоянии вещества (например, твердое вещество или жидкость).
Движущееся соединение известно как подвижная фаза, в то время как устойчивое вещество (которое вообще не движется) называется стационарной фазой. Компоненты подвижной фазы отделяются, когда она движется по стационарной фазе. Затем химики могут анализировать отдельные компоненты один за другим.
4 разных типа хроматографии
Существует несколько видов хроматографии, каждый из которых имеет свой вид подвижной и стационарной фазы. Хотя основной принцип остается тем же самым, способ взаимодействия различных компонентов с подвижной фазой и стационарной фазой может варьироваться в зависимости от используемого хроматографического метода.
Ниже приведен список основных типов хроматографии, которые помогут вам получить более полное представление о процессе. Мы попытались объяснить их очень простым языком.
1. Бумажная хроматография
Бумажная хроматография является наиболее распространенным и простым аналитическим методом для разделения и обнаружения цветных компонентов, таких как пигменты. Хотя в современных лабораториях чаще используют тонкослойную хроматографию, он все еще является мощным учебным пособием.
В этом методе каплю образца смеси (например, чернил) помещают вблизи края фильтровальной бумаги, а затем бумагу подвешивают вертикально, при этом ее край погружают в растворитель (вода или спирт). Бумагу подвешивают таким образом, что пятно чернил не должно касаться растворителя и остается немного над ним.
Через некоторое время растворитель (подвижная фаза) начинает постепенно продвигаться вверх по бумаге (неподвижная фаза) посредством капиллярных сил. Поскольку растворитель движется вверх, он увлекает красители, присутствующие в чернилах, вместе с ним.
Когда он поднимается, мы видим разные цвета на фильтровальной бумаге. Эти цвета представляют различные красители, присутствующие в чернилах. Поскольку разные красители имеют разные уровни растворимости и движутся с разной скоростью, когда растворитель поднимается, мы видим полосы разного цвета на разной высоте.
Вот как бумажная хроматография используется для разделения разных компонентов чернил. В некоторых случаях смеси не содержат цветных компонентов, поэтому химики добавляют другие вещества для идентификации.
2. Тонкослойная хроматография
Тонкослойная хроматография очень похожа на бумажную хроматографию. Основное отличие состоит в том, что вместо куска бумаги у нас есть предметное стекло, покрытое слоем силикагеля (неподвижная фаза). В этом методе на нижний край предметного стекла с силикагелем наносятся капли раствора исследуемой смеси, лежащие на отрезке, параллельном нижнему краю и отстоящем от него на такое расстояние, чтобы капли не погружались в элюент.
Когда они подсохнут, предметное стекло нижним краем погружается в слой растворителя (элюент). Предметное стекло с неподвижной фазой удаляется из резервуара с растворителем, когда растворитель (подвижная фаза) достигает верхнего края стекла. Различные соединения в смеси перемещаются вверх по слою силикагеля с различной скоростью в виде пятен. Эти отделенные пятна затем визуализируются в ультрафиолетовом свете.
В некоторых случаях для визуализации пятен используются химические процессы: например, серная кислота обугливает большинство органических компонентов, оставляя темное пятно на предметном стекле. Это простая и быстрая техника для разделения смесей органических соединений. Она часто используется для определения пигментов, анализа состава красителей в волокнах и выявления инсектицидов или пестицидов в пищевых продуктах.
По сравнению с бумажной хроматографией, применение тонкослойной хроматографии приводит к лучшему разделению.
3. Газовая хроматография
Обычно количество пробы газа невелико, порядка микролитров. Подвижную фазу в газовой хроматографии называют газом-носителем. Поскольку мы не хотим, чтобы газ-носитель (подвижная фаза) реагировал с образцом, это должен быть инертный газ, такой как гелий, или нереакционноспособный газ, такой как азот. Колонка для газовой хроматографии (металлическая или стеклянная трубка) содержит неподвижную фазу тонкий слой жидкости или полимера на инертной твердой подложке.
Разделение компонентов в смеси происходит за счет разницы в их температурах кипения – соединения с низкой температурой кипения движутся быстрее компонентов с более высокой температурой кипения, а также за счет полярности и других специфических взаимодействий с подвижной фазой.
Это приводит к тому, что каждый компонент элюируется в разное время, также называемое временем удерживания компонента. Сравнивая времена удерживания разделенных компонентов с временами удерживания известных соединений, химики могут анализировать соединения в смеси.
4. Жидкостная хроматография
Колонка обычно представляет собой металлическую или пластиковую трубку, заполненную крошечными частицами сорбента с определенным химическим составом поверхности. Поскольку каждое соединение в смеси по-разному реагирует с сорбентом (из-за различий в размерах, адсорбции и ионного обмена), они движутся в колонке с разными скоростями, что обеспечивает разделение их между собой. Выбор состава подвижной фазы зависит от свойств неподвижной фазы и анализируемых веществ.
Химики проводят серию тестов и отрабатывают методику разделения, чтобы найти оптимальный метод жидкостной хроматографии для смеси, который может обеспечить идеальное разделение пиков.
Применение
За научные исследования в области хроматографии или с применением хроматографического метода были присуждены несколько Нобелевских премий.
Более 60 процентов химических исследований во всем мире проводится с помощью различных видов хроматографии. Современные хроматографы способны разделить и идентифицировать несколько сотен соединений за один анализ. Некоторые хроматографические детекторы могут определять количество вещества в масштабе ppb.
Благодаря этим преимуществам, хроматография в настоящее время широко используется в
Помимо этого, хроматография также используется для расшифровки ДНК и в биоинформатике, клинической диагностике заболеваний и расстройств, а также в различных исследовательских целях.
1 Е.М. Сенченкова. Михаил Семенович Цвет. Москва: Издательство «Наука», 1973
2 М.С. Цвет «Хроматографический адсорбционный анализ. Избранные работы. Под ред. А.А. Рихтера и Т.А. Красносельской. Изд-во АН СССР. 1946
3 Измайлов Н.А., Шрайбер М.С.. Капельно-хроматографический метод анализа и его применение в фармации. Фармация. 1938, №3.с.1-7
4 Р.Х. Хамизов, В.Ф. Селеменев. Кто открыл газовую хроматографию? // Сорбционные и хроматографические процессы. 2018. Т. 18. № 2. С 128-130
5 «Сто лет хроматографии» В. А. Даванков, Я. И. Яшин // Вестник РАН, 2003, том 73, № 7, с. 637-646
6 Nomenclature for Chromatography // Pure and Appl. Chem. 1993.Т. 65, № 4. С. 819—872
БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, вид хроматографии, основанный на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке р-рителя (элюента). Хроматограммой в этом случае называют картину расположения хроматографич. зон на бумаге после завершения разделения. В бумажной хроматографии используется гл. обр. спец. хроматографич. бумага, к-рая должна быть максимально однородной и содержать только целлюлозные волокна. Она может служить неподвижной фазой или инертным носителем неподвижной фазы.
В ионообменной бумажной хроматографии используют бумагу, пропитанную ионообменными смолами. Скорость миграции компонентов в этом случае зависит гл. обр. от констант ионного обмена и рН элюента.
Осадочная бумажная хроматография осуществляется на бумаге, импрегнированной р-ром реагента-осадителя, образующего с разделяемыми в-вами малорастворимые соединения. Скорость движения компонентов определяется произведениями р-римости этих соединений.
В лигандообменной бумажной хроматографии бумагу предварительно обрабатывают р-рами ионов металлов, напр. Сu 2+ при разделении аминов и аминокислот. При этом компоненты перемещаются в зависимости от констант устойчивости их комплексных соед. с ионами металлов.
После подъема р-рителя на определенную высоту бумагу вынимают из камеры, высушивают и выявляют хроматографич. зоны. Если зоны не окрашены, хроматограмму опрыскивают р-рами специфич. реагентов, образующих с компонентами разделяемой смеси окрашенные или флуоресцирующие соединения. Используют также ферментативные и биол. методы детектирования, напр., для выявления ферментов хроматограмму обрабатывают р-ром соответствующих субстратов. Радиоактивные в-ва обнаруживают, экспонируя хроматограмму на рентгеновскую пленку.
Положения хроматографич. зон в бумажной хроматографии характеризуют величиной Rf, представляющей собой отношение пути, пройденного центром хроматографич. зоны, к пути, пройденному фронтом р-рителя: Rf= 1/[1 + (KdVs/Vm)], где Кs и Vт— объемы соотв. неподвижной и подвижной фаз, Кd-коэф. распределения в-ва между этими фазами. Погрешность определения Rf ок. 5%. В стандартизованных условиях эта величина постоянна для каждого в-ва и используется для его идентификации.
С помощью бумажной хроматографии можно разделить и анализировать практически все классы хим. соед., в т.ч. аминокислоты, сахара, стероиды. Кроме того, бумажная хроматография в сочетании с двумерным электрофорезом используется как микропрепаративный метод разделения природных в-в, в частности пептидов.
Достоинства бумажной хроматографии: возможность разделения малых кол-в (0,001-1 мкг) в-в, высокая чувствительность, простота аппаратуры. Недостаток метода: сильное размывание хроматографич. зон, связанное с неоднородностью бумаги. Вследствие этого для разделения сложных смесей в-в необходимо использовать листы длиной ок. 1 м, что приводит к увеличению длительности эксперимента (для двумерной бумажной хроматографии до 15-20 ч) и большому расходу р-рителя.
===
Исп. литература для статьи «БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ» : Хроматография на бумаге, пер. с чеш., М., 1962; Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам, пер. с англ., т. 1, М., 1982, с. 58-151. Б. Г. Беленький.
Страница «БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ» подготовлена по материалам химической энциклопедии.
Хроматография на бумаге (ОФС.1.2.1.2.0002.15)
» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>
Хроматография на бумаге (ОФС.1.2.1.2.0002.15)
Хроматография на бумаге – хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы.
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Взамен ст. ГФ XI, вып.1
Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы, называется хроматографией на бумаге.
Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, предварительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным или адсорбционным. Перемещение подвижной фазы происходит либо только под действием капиллярных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).
При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге зоны адсорбции в виде круглых или овальных пятен или полос в зависимости от способа нанесения (в точку или полосой). Совокупность зон адсорбции, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хроматограммой.
Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется фактором удерживания Rf, (см. ОФС «Хроматография»).
Область применения
Бумажная хроматография может использоваться для установления подлинности, чистоты и количественного определения анализируемого вещества.
Подлинность подтверждается при одновременном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стандартного вещества. Если образцы идентичны, то соответствующие им зоны адсорбции на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения Rf. Для идентификации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно наблюдаться одно пятно, характеризующее зону адсорбции. Условия хроматографирования следует подбирать так, чтобы значения Rf были отличны от 0 и не превышали 1. Кроме того, для подтверждения подлинности анализируемого вещества могут быть использованы конкретные условия его детекции, указанные в фармакопейной статье.
При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения Rf. О степени чистоты анализируемого вещества можно судить по величине и интенсивности окраски (или поглощения) обнаруживаемых на хроматограмме зон адсорбции примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бумаги одновременно хроматографируют определенное количество анализируемого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c различными, точно известными концентрациями. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее зону адсорбции на хроматограмме по совокупности площади зоны адсорбции и интенсивности окраски (или поглощения) с зонами адсорбции свидетеля.
Для количественного анализа применяют специальные приборы, позволяющие проводить измерения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для обработки хроматограмм в видимой области спектра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.
можно также проводить количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого зоны адсорбции вырезают и экстрагируют определяемое вещество подходящим растворителем. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом, пригодным для определения малых концентраций и учитывающим строение анализируемого вещества.
Проба испытуемой смеси может наноситься либо точечно на линию старта, либо в виде равномерной полосы вдоль всей линии старта, при этом первичная зона адсорбции будет иметь вид пятна, а во втором случае – полосы, параллельной линии старта.
Оборудование
Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизированные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие наблюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры. Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришлифованной крышкой и дополнительно герметизированные. На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.
При проведении нисходящей хроматографии в верхней части камеры помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, однократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать ширину листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена устройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем положении и для ввода в лодочку подвижной фазы.
При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу помещают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо наливают на дно камеры.
Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворителей, входящих в состав подвижной фазы.
Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в фармакопейных статьях.
Методики хроматографического разделения
Бумажная хроматография может быть одномерной и двумерной.
Одномерная бумажная хроматография предполагает точечное нанесение или нанесение в виде полосы пробы исследуемой смеси на линию старта и последующее хроматографирование в одном направлении (рис. 1).
Рисунок 1. Примерная схема одномерной бумажной хроматографии
Двумерная хроматография предполагает последовательное прохождение подвижной фазы в двух перпендикулярных направлениях, что позволяет обеспечить более четкое разделение смеси анализируемых веществ (рис. 2).
Рисунок 2. Примерная схема двумерной бумажной хроматографии
Нисходящая хроматография
На дно хроматографической камеры помещают неподвижную или подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 2,5 см. Камеру закрывают и оставляют для насыщения на 24 ч при постоянной температуре. В отдельных случаях, при использовании достаточно летучих растворителей, это время может быть сокращено.
Растворы веществ наносят на линию старта микропипеткой или микрошприцем так, чтобы расстояние между точками нанесения отдельных проб было не менее 3 см. Если минимальное, необходимое для проведения хроматографирования количество анализируемого раствора может образовывать на бумаге первичную зону адсорбции в виде пятна, превышающего в диаметре 10 мм, нанесение проводят в несколько приемов, предотвращая путем подсушивания чрезмерную диффузию на линии старта. После нанесения растворов анализируемых веществ и высыхания образовавшейся при этом первичной хроматограммы полосу бумаги закрепляют в рабочем положении в камере и оставляют на 1,5 ч. В рабочем положении полоса хроматографической бумаги должна висеть вертикально так, чтобы между ее верхним концом, погруженным в лодочку, и линией старта был лишь один, по возможности плавный, перегиб. По окончании выдержки начинают хроматографирование, для чего в лодочку вливают подвижную фазу. Хроматографирование обычно заканчивают при приближении фронта подвижной фазы к нижнему концу полосы бумаги. Если в фармакопейной статье нет специальных указаний, полосу вынимают из камеры и сушат на воздухе, отметив графитовым карандашом конечное положение фронта подвижной фазы. Детекцию зон адсорбции осуществляют согласно указаниям фармакопейной статьи.
Восходящая хроматография
Для проведения восходящей хроматографии на бумаге используют камеры, в которых сосуд (лодочка) с подвижной фазой располагается в нижней части или на дне. Полоса хроматографической бумаги закрепляется в верхней части камеры так, чтобы обеспечить возможность погружения нижнего конца полосы в лодочку с подвижной фазой. В рабочем положении полосы линия старта должна отстоять от поверхности подвижной фазы на 2 – 3 см. В остальном приемы работы при проведении восходящей хроматографии на бумаге не отличаются от описанных выше.
Подготовка фаз и бумаги
При приготовлении несмешивающихся систем растворителей, совместно используемых при хроматографии в качестве подвижной и неподвижной фазы, необходимо обеспечить их взаимное насыщение, например, путем встряхивания в делительной воронке. При этом в фармакопейной статье должно быть указано, какую из фаз используют для хроматографирования.
Фильтровальную бумагу нужной плотности квалификации «для хроматографии» разрезают в направлении, перпендикулярном или параллельном волокнам, на листы (полосы), длина которых приблизительно равна высоте камеры. Ширина этих полос может быть приблизительно определена по формуле: А = 3(К + 1), где А – ширина полосы (см), К – количество хроматограмм на полосе.
На каждой полосе бумаги для обозначения мест нанесения хроматографируемых веществ графитовым карандашом проводят прямую линию, называемую линией старта. Расстояние от конца полосы бумаги до линии старта выбирается так, чтобы при погружении бумаги в лодочку исключалось непосредственное соприкосновение нанесенных на линию старта веществ с жидкостью, находящейся в лодочке.
На приготовленные таким образом листы фильтровальной бумаги, если указано в фармакопейной статье, наносят неподвижную фазу. Для этого соответствующие труднолетучие растворители (формамид, пропиленгликоль и т.п.) смешивают с легколетучими растворителями и в полученную смесь на 1 – 2 с погружают подлежащие обработке листы бумаги. Избыток смеси с поверхности листов снимают, обжимая их между двумя слоями фильтровальной бумаги, после чего летучий компонент смеси удаляют высушиванием на воздухе в течение 15 – 20 мин.
Если в качестве неподвижной фазы рекомендован водный раствор нелетучих веществ, то бумагу обрабатывают этим раствором, сушат, как указано выше, а перед хроматографированием выдерживают в камере, содержащей пары воды. Нанесение на бумагу легколетучих компонентов неподвижных фаз осуществляется путем выдерживания ее в парах фазы в камере непосредственно перед хроматографированием.
Детекция зон адсорбции
По окончании хроматографирования хроматограммы подсушивают до удаления следов растворителей и просматривают в видимом или ультрафиолетовом свете (при определенной длине волны детектора, указанной в фармакопейной статье), отмечая при этом зоны адсорбции. В ряде случаев для обнаружения зон адсорбции хроматограмму подвергают обработке специальными реагентами, образующими с анализируемыми веществами окрашенные продукты реакции, путем опрыскивания или погружения в раствор реагента.
Способ детекции зон адсорбции должен быть обязательно указан в соответствующей фармакопейной статье на лекарственное средство.