Для чего в буфер для пцр добавляют соли магния

Дополнения, комментарии, вопросы

Здравствуйте. Откликнитесь, пожалуйста, те, кто работает с пшеницей. Что используете в качестве положительного контроля, и если можно киньте ссылки. Работа застряла. Есть праймеры к пшеничному b-актину, но работать не хотят. Крепнет подозрение, что что-то с ними не то. Тем более статья, откуда дернули последовательности была какая-то сомнительная-не ссылок, не номеров.
Буду отшень признателен.

а не подскажете сколько ксиленцианола можно добавить в ПЦР смесь?

Источник

Для чего в буфер для пцр добавляют соли магния

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).

Многочисленные открытия в области молекулярной биологии и генетики способствовали открытию ПЦР.В 1869 г. И. Мишер выделил вещество из клеток гноя, которое содержало азот и фосфор. Изначально вещество назвали нуклеином, а когда были определены его кислотные свойства нуклеиновой кислотой.В 1944 г. были проведены эксперименты по трансформации бактерий учеными О. Эвери, К. Маклауда и М. Маккарти. В ходе этих экспериментов было доказано, что за трансформацией бактерий (приобретением болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в неё убитых кипячением болезнетворных бактерий) стоит выделенная из пневмококков ДНК.В 1952 г. учеными А. Херши и М. Чейзом был проведен эксперимент с помеченными радиоактивными изотопами ДНК и белками. В результате они выяснили, что в зараженную клетку передается только нуклеиновая кислота, а не белок, как считалось ранее.В 1949–1951 гг. были сформулированы «правила Чаргаффа». Группа биохимика Э. Чаргаффа установила количественное соотношение между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК.

Правила Чаргаффа и данные рентгеноструктурного анализа Розалинд Франклин сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК. На основе этих данных в 1953 году Дж. Уотсоном и Ф. Криком был установлен принцип комплементарности. Ученые сделали вывод о том, что ДНК представляет собой двойную полипептидную цепь, образующую спираль благодаря водородным связям между азотистыми основаниями (аденин-тимин и гуанин-цитозин).В 1955 г. произошло открытие фермента ДНК-полимераза А. Корнбергом. Этот фермент способен удлинять полипептидную цепь присоединяя к 3’-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид. Для этого необходимо, чтобы праймер связался с цепью ДНК (матрицей) по принципу комплементарности. Чтобы реакция прошла раствор должен содержать нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), которые используются в качестве «строительного материала». В 1971 г. Клеппе с соавторами определили состав реакционной смеси, и принципы использования ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако, из-за технологической сложности искусственного синтеза праймеров и нестабильности реакции, метод ПЦР было невозможно использовать на практике в полной мере.В 1975 г. Т. Брок и Х. Фриз открыли Thermusaquaticus (грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию). А в 1976 г. была выделена Taq-полимераза – фермент, который способен работать при повышенных температурах (оптимум 72–80°C).В 1983–1984 гг. К. Мюллисом был проведен ряд экспериментов по разработке ПЦР. Ученый первый начал использовать вместо ДНК-полимеразы устойчивую к высоким температурам Taq-полимеразу, что позволило ускорить работу по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллисом в соавторстве с Ф. Фалуном был разработан алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.

Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Метод продолжает развиваться, появляются новые модификации, но мы предлагаем рассмотреть методику проведения классической ПЦР.

Методика полимеразной цепной реакции

Метод постановки ПЦР требует наличия в реакционной смеси ряда основных компонентов: праймеры, Taq-полимераза, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, буфер, анализируемый образец.

Праймеры – искусственно синтезируемые олигонуклеотиды, как правило, размером от 15 до 30 нуклеотидов, которые идентичны соответствующим участкам ДНК-мишени. Играют ключевую роль в амплификации, образуя продукты реакции.

Для полимеразной цепной реакции последовательности праймеров очень важны, потому что реакционный цикл имеет определенные величины температур, используемые на этапах нагрева и охлаждения.

Кроме того, большой избыток праймеров в реакционной смеси ПЦР приводит к тому, что они с большей вероятностью сталкиваются с частично комплементарным праймером, чем с полностью комплементарной ДНК матрицой. Таким образом, следует избегать комплементарностипраймеров друг другу.

Taq-полимераза – термостабильный фермент, который обеспечивает достраивание З’-конца второй цепи ДНК по принцип комплементарности. Этот фермент довольно часто используется при проведении стандартной ПЦР.

Taq ДНК полимераза имеет оптимальную температуру репликации – 75–80°C и выдерживает длительное воздействие температур до 96°C. Таким образом, она может оставаться активной после каждого из шагов денатурации.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – «строительный материал», который используется Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Включает в себя дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ).

Для оптимального включения оснований в синтезируемую цепь ДНК их обычно добавляют к реакционной смеси ПЦР в эквимолярных количествах. Как правило, конечная концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 0,2 мМ.

Буфер – смесь катионов и анионов используемая в определенной концентрации, обеспечивающая оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Значение рН буфера колеблется от 8,0 до 9,5 и стабилизируется Трис-HCl.

Одним из компонентов буфера Taq-полимеразы является ион калия (KCl), который способствует отжигу праймеров. Буферная концентрация ионов магния является еще одним важным фактором для правильного функционирования ДНК-полимеразы. Ионы магния служат кофактором для ДНК полимеразы.

Анализируемый образец – вносимый в реакционную смесь препарат, обычно содержащий искомую ДНК, служащую мишенью для амплификации. В случае отсутствия ДНК-мишени продукт не образуется.

Иногда для удобства детекции или контроля эффективности в состав реакционной смеси могут быть внесены дополнительные компоненты.

Внутренние контроли – несвойственный данному организму фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймерами. Практически представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке.

ДНК-зонды – искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера (около 30 нуклеотидов), комплементарные специфическим ампликонам (продуктам реакции). Могут использоваться для детекции продуктов ПЦР, благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам.

Для улучшения результатов ПЦР используются различные ПЦР добавки. Эти компоненты способны понижать температуру денатурации матрицы или стабилизируют ДНК-полимеразу.

Обычно используемые ПЦР-добавки включают диметилсульфоксид (ДМСО), сульфат аммония, полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин (BSA), желатин, N-триметилглицин и глицерин.

Если в пробе имеется искомая ДНК, с ней происходит ряд последовательных цикличных реакций, которые различаются температурными режимами.

Амплификация может включать в себя множество циклов, но все они состоят из трёх этапов: денатурация, отжиг, элонгация [1].

Денатурация – процесс перехода двухнитевой формы ДНК в однонитевую из-за разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований при воздействии высоких температур.

Отжиг – процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит благодаря правилу комплементарностиЧаргаффа. Без соблюдения этих условий праймеры не отжигаются.

Элонгация (синтез). Taq-полимераза достраивает вторую цепь ДНК с 3’-концапраймера.

Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы. Затем она максимально эффективно начинает синтезировать вторую цепь ДНК от 3’-конца праймера, который связан с матрицей, и продвигается в направлении от 3’ к 5’ концу.

Результатом ПЦР будет экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, описываемое формулой

где А – количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации; М – начальное количество ДНК-мишеней; n – число циклов амплификации.

Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

Помимо классического варианта ПЦР существует также множество других вариантов постановки ПЦР, которые направлены на решение многих задач: увеличение эффективности реакции и снижения риска образования неспецифических продуктов; реализацию возможности проведения качественного и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК/РНК [2].

В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются:

ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) – суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров.

В момент постановки ПЦР полимеразная активность фермента блокируется антителами или небольшими молекулами типа Affibody, имитирующими антитела, до наступления первой денатурации (при 95°C в течение 10 минут).

ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) – предназначен для амплификации, выделения или идентификации последовательности РНК. Сперва проводят синтез одноцепочечной молекулы ДНК (кДНК), с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), используя для матрицы мРНК. Затем образовавшуюся кДНК используют для последующей ПЦР.

Возможность использовать РНК в качестве мишени для ПЦР расширяет спектр применения метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК.

ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (End-point PCR) – эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Однимизвариантовявляетсяметод «FLASH» (FLuorescentAmplification-basedSpecificHybridization – специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами).

ПЦР в режиме «реального времени» (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) – используется одновременно для амплификации и измерения количества искомой молекулы ДНК. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени.

Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР – амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т.д., поместив проб в одну пробирку.

Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования.

Организация ПЦР-лаборатории и необходимое оборудование

Для предотвращения контаминации исходных образцов используют одноразовые пробирки с плотно закрывающимися крышками и наконечники к микродозаторам, термостаты с твердотельнымтермоблоком, специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок. Смена наконечников является обязательной после каждой проведенной манипуляции [3].

Для каждого отдельного помещения предусмотрено наличие холодильников и морозильников для поддержания определенной температуры, вортексов и ротаторов для перемешивания, центрифуг различной мощности для перемешивания и разделения образцов. Также необходимо наличие комплекта дозаторов различного диапазона объемов и подходящих для них наконечников, штативов для микропробирок, самих микропробирок (центрифужных, градуированных и пр.) различных объемов. Все комнаты должны быть оснащены бактерицидными рецикуляторами для дезинфекции воздуха при помощи УФ, все рабочие поверхности и наружные поверхности корпусов приборов должны быть устойчивы к дезинфекции. Помимо перечисленного списка каждая зона лаборатории должны содержать конкретный набор приборов, необходимых для выполнения соответствующих задач.

Организация зон лаборатории представлена на схеме [4].

Зона приема, регистрации и первичной обработки материала должна быть оборудована центрифугами для осаждения и разделения компонентов проб.

В зоне выделения НК необходимо наличие:

• абактериального бокса для защиты исследователя от патогенных агентов, передающихся воздушно-капельным путем;

• процессора магнитных частиц для экстракции НК;

• нанофотометра для определения количества и качества выделенной из образка ДНК/РНК;

• термостата для поддержания постоянной температуры в пробирках, помещенных в гнезда термоблока;

• дистиллятора для получения дистиллированной воды.

• Зона приготовления реакционной смеси и проведения ПЦР должна содержать:

• амплификатор, необходимый для нагрева/охлаждения пробирок;

• бокс для стерильных работ для обеспечения защиты от контаминации при выделении ДНК и подготовке реакционной смеси.

1 – зона приема, разбора и первичной обработки материала;

2 – зона подготовки проб и выделения НК;

3 – зона приготовления реакционных смесей, проведения ОТ и ПЦР;

4 – зона детекции результатов методом электрофореза и ГиФА;

5 – комната анализа результатов;

7 – комната обеззараживания материала.

Обязательными для зоны детекции результатов являются:

• камера для электрофореза – разделения продуктов амплификации нуклеиновых кислот, а также источник питания, преобразующий переменный ток в постоянный;

• система гель-документации для регистрации результатов и воспроизведения электрофореграмм, включающая в себя трансиллюминатор для детекции результатов в УФ спектре, а также компьютер;

• электронные прецизионные весы для приготовления агарозного геля, который используется при электрофорезе;

• электрическая плитка для тех же целей.

В последней, но немаловажной зоне дезинфекции материалов необходим паровой стерилизатор для обработки образцов водяным паром под давлением.

Состав оборудования может варьировать в зависимости от размера лаборатории и других факторов.

Метод ПЦР находит применение в различных областях диагностики. Его применяют для выявления в клинических образцах вирусов, бактерий, простейших, а также для обнаружения приобретенных и врожденных генетических нарушений и идентификации личности [5].

Автоматизация этапов денатурации, отжига и элонгации с применением современного оборудования позволяет упростить проведение анализа и способствует его широкому применению в различных областях диагностики. Однако повсеместное внедрение данного метода ограничивается необходимостью ручной и трудоемкой подготовки проб идетекции результатов, а также необходимостью в оснащенной лаборатории со всеми необходимыми реактивами и оборудованием.

Сфера применения полимеразной цепной реакции в дальнейшем будет расширяться, т.к. все чаще в клинической практике имеют дело с очень небольшим количеством исследуемого материала, анализ которого возможен только этим методом.

Появление все новых видов ПЦР способствует охвату большего спектра возможностей для применения метода, упрощает и ускоряет его проведение, тем самым позволяя получить наиболее точный, верный и быстрый результат.

Источник

Основные компоненты ПЦР смеси и их функции

5 компонентов ПЦР играют решающую роль в амплификации ДНК.

Обязательными элементами реакционной смеси для полимеразной цепной реакции являются:

ДНК матрица для ПЦР амплификации

Множество различных биологических объектов могут служить источником ДНК для 3 основных стадий полимеразной цепной реакции.

ПЦР является высокочувствительным методом и для успешной амплификации требуется присутствсие только одной или двух молекул ДНК. Тем не менее, оптимальное количество ДНК для ПЦР амплификации зависит от состава ДНК и используемой ДНК-полимеразы.

Важно оптимизировать количество используемой ДНК, потому что высокие количества приводят к неспецифической амплификации, тогда как низкие количества уменьшают производительность полимеразной цепной реакции.

Обычно 0,1-1 нг плазмидной ДНК или 5-50 нг геномной ДНК достаточно для ПЦР реакционной смеси объемом 50 мкл.

Функция дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) в ПЦР

Для оптимального включения оснований в синтезируемую цепь ДНК их обычно добавляют к реакционной смеси ПЦР в эквимолярных количествах.

Как правило, конечная концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 0,2 мМ.

Состав ПЦР буфера

Буфер реакционной смеси ПЦР служит химической средой для поддержания активности и стабильности ДНК полимеразы. РН буфера обычно колеблется от 8,0 до 9,5 и часто стабилизируется Трис-HCl.

Одним из компонентов буфера Taq-полимеразы является ион калия (KCl), который способствует отжигу праймеров.

Буферная концентрация ионов магния является еще одним важным фактором для правильного функционирования ДНК-полимеразы. Ионы магния служат кофактором для ДНК полимеразы.

Кроме этого, ионы магния облегчают образование комплекса между праймерами и матрицами ДНК стабилизируя отрицательные заряды фосфатных групп в скелете ДНК.

Как правило, концентрация магния составляет 1,5 мМ.

Более высокая концентрация магния связана с более высоким выходом конечного продукта, но более низкой специфичностью полимеразы, тогда как меньшая концентрация магния связана с пониженной активностью и повышенной специфичностью фермента.

Роль праймеров ПЦР

Для ПЦР требуются знание последовательности ДНК, которые ограничивают синтезируемый фрагмент.

Праймеры представляют собой короткие нуклеотидные последовательности (синтетические олигонуклеотиды около 15-30 оснований длиной), которые спариваются с реплицируемой ДНК матрицей.

Для того чтобы происходила гибридизация нуклеотидов праймеров с ДНК матрицей, праймеры должны иметь последовательность, которая комплементарна 3′-концу каждой цепи последовательности ДНК мишени, а также 3′-концы гибридизованных праймеров должны указывать друг на друга.

Для полимеразной цепной реакции последовательности праймеров очень важны, потому что реакционный цикл имеет определенные величины температур, используемые на этапах нагрева и охлаждения.

Кроме того, большой избыток праймеров в реакционной смеси ПЦР приводит к тому, что они с большей вероятностью сталкиваются с частично комплементарным праймером, чем с полностью комплементарной ДНК матрицой. Таким образом, следует избегать комплементарности праймеров друг другу.

Два олигонуклеотидных праймера должны быть смоделированны и химически синтезированы.

Возрастающее количество биоинформатических ресурсов помогает при разработке праймеров и делает дизайн и выбор условий реакции намного более простыми. Эти ресурсы позволяют вводить ДНК последовательности, подлежащие амплификации, выбирать длину праймера и другие детали дизайна. После анализа эти программы предоставляют набор подходящих последовательностей праймеров.

Используя подходящие последовательности, ДНК праймеры могут быть синтезированы в течение нескольких дней.

Функция Taq ДНК-полимеразы в ПЦР

Taq ДНК-полимераза является наиболее часто используемым ферментом для стандартной ПЦР.

Taq ДНК-полимераза представляет собой фермент, который реплицирует ДНК. ДНК-полимеразы распознают праймеры как участки с которых начинается синтез.

Благодаря способности автоматизировать реакцию ПЦР были созданы термоциклеры, дающие возможность устанавливать температуру и время для каждой реакции ПЦР.

Помимо этого термостабильного свойства, Taq-полимераза является обыкновенной ДНК-полимеразой. Она синтезирует новую цепочку ДНК, комплементарную одноцепочечной ДНК матрице, и, как и другие ДНК-полимеразы, для ее синтеза требует наличия праймера.

У Taq полимеразы отсутствует коррекционная активность и она неспособна исправлять неправильные встроенные нуклеотидные основания. В среднем эти ошибки происходят примерно один раз на каждые 9000 нуклеотидов.

Это свойство может быть важно в некоторых применениях ПЦР, например при клонировании, потому что продукт ПЦР может быть не совсем точной копией исходной последовательности.

Еще одним недостатком Taq полимеразы является то, что она может эффективно амплифицировать только фрагменты в несколько тысяч пар оснований.

Фрагмент ДНК, подлежащий амплификации, не должен превышать

3 kb. Обычно он имеет длинну менее 1 kb.

Амплификация очень длинных фрагментов (до 40 kb) требует специальных методов.

Эти проблемы могут быть решены с использованием других термостабильных полимераз, таких как ДНК-полимеразы Pfu и Pwo. Эти ферменты обладают коррекционной активностью.

Для повышения эффективности ПЦР были разработаны новые поколения ДНК-полимераз. Так как они производят продукты ПЦР более низкой частотой ошибок, то они эффективны для клонирования, амплификации длинных участков и участков, содержащих большое количество GC оснований.

Дополнительные компоненты реакции ПЦР

Для улучшения результатов ПЦР существуют различные ПЦР добавки. Эти компоненты полимеразной цепной реакции могут понижать температуру денатурации матрицы или способствуют стабилизации ДНК-полимеразы.

Обычно используемые ПЦР-добавки включают диметилсульфоксид (ДМСО), сульфат аммония, полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин (BSA), желатин, N, N, N-триметилглицин и глицерин.

Источник

• ← Для чего в бутылке с маслом прорези в горлышке
• Для чего в бюстгальтере пуш ап →