Что такое дифференцировка клеток в процессе эмбрионального развития

Некоторые этические вопросы технологии эмбриональных стволовых клеток

Дифференцировка – необратимое развитие различий между изначально (у эмбриона первых стадий делений дробления) однородными клетками с образованием специализированных клеток, стадий и органов.

Плюрипотентные (П) стволовые клетки (СК) – клетки, произошедшие от эмбриона ранних стадий развития, способные дифференцироваться в различные типы клеток, но не в эмбрион. ПСК мигрируют к местам своего конечного расположения, пролиферируют и дифференцируются в один из нескольких возможных типов коммитированных клеток. ПСК функционируют и во взрослом организме.

Соматические клетки – клетки тела иные, чем половые (женские или мужские) клетки.

Стволовые клетки (СК) – недифференцированные клетки, способные к самоподдержанию (самообновлению), к дифференцировке. Обладающие детерминацией – возможностью выбора направления дифференцировки. СК – гетерогенны, среди них имеются “транзитные” СК, находящиеся в процессе перехода в более дифференцированное состояние. СК функционируют в своем окружении – нише, исключающем дифференцирующее влияние, обеспечивающем длительную пролиферацию. Транзитные СК имеют меньший пролиферативный потенциал.

Тотипотентные (Т) СК – клетки эмбриона ранних стадий дробления, имеющие неограниченные способности дифференцироваться в эмбрион, экстраэмбриональные оболочки и ткани, в любой тип клеток, тканей и органов организма.

Трансгенный организм – в геном которого введена и экспрессируется экзогенная ДНК.

Унипотентные СК – от которых дифференцируется только один тип клеток.

В данном обзоре обсуждается вопрос о тотипотентности и плюрипотентности эмбриональных клеток и не затрагивается проблема тоти- и плюрипотентности ядер, связанной с программированием. Репрограммирование генома клеточного ядра – отдельная биологическая проблема.

Преимплантационное и первые этапы постимплантационного развития эмбриона человека

Эмбриональное развитие человека можно разделить на два периода:

1) преимплантационное развитие, от момента оплодотворения до стадии бластоцисты (до 6 дня после оплодотворения);
2) постимплантационное развитие (от 6 дня до 40 нед беременности – до рождения).

Оплодотворение происходит в период 24 ч после овуляции ооцита в верхнем отделе яйцевода; после чего в оплодотворенной яйцеклетке мужской и женский пронуклеусы сливаются; объединяются наборы хромосом от мужского и женского пронуклеусов. Формируется одноклеточная стадия эмбриона –-зигота. Затем зигота вступает в дробление посредством митотических делений. Первое дробление зиготы происходит в трубе матки примерно через 1,5–2,5 дня после оплодотворения (ПО). Формируется эмбрион человека на двухклеточной стадии, каждая из этих двух клеток (бластомеров) имеет равные потенции (т.е.тотипотентные) для развития в самостоятельный эмбрион. На 3–4-й дни ПО формируется морула – многоклеточная стадия. На всех этих стадиях ( до имплантации) эмбрион окружен неклеточной прозрачной мембраной, блестящей оболочкой. Полагают (для млекопитающих), что до 8-клеточной стадии бластомеры морфологически идентичны друг другу и являются тотипотентными, что проявляется в способности каждого из этих бластомеров формировать все типы клеток и тканей, дифференцироваться в эмбрион, его оболочки и ткани и в экстраэмбриональные оболочки.

В период 7–14 дней ПО имплантирующаяся бластоциста все глубже заключается в эндометрий матки. Во время гаструляции формируется полярность – переднезадняя ось эмбриона. На 15–16 дни происходит перемещение клеток наружного слоя эмбриобласта к его будущему заднему краю, формируется примитивная первичная полоска по средней линии диска. На переднем конце первичной полоски клеточное скопление формирует гензеновский узелок. Позже по продольной средней линии первичная полоска продавливается вглубь, образуется первичная бороздка. Клетки эмбриобласта, мигрирующие через первичную полоску и гензеновский узелок, формируют эмбриональную энтодерму и мезодерму, а также – нотохорд, интегрирующийся затем в энтодерму первичной кишки. Предшественники эктодермы локализованы впереди первичной полоски.

Из энтодермы желточного мешка формируется зачаток кишки. В мезенхиме желточного мешка возникают первые кровяные островки, из которых формируются первые кровяные клетки и сосуды эмбриона. Примордиальные половые клетки (гоноциты) выявляются по наличию в них высокой активности щелочной фосфатазы у 15–20 дневных эмбрионов [9]. Полагают, что они возникают (обособляются) либо в эпибласте, либо в эмбриональной эктодерме и оттуда через энтодерму желточного мешка и эктодерму первичной кишки гоноциты мигрируют в область будущих зачатков гонад до 32 дня эмбриогенеза. Зачатки гонад (половые валики) у человека развиваются как индифферентные (бипотенциальные) образования на вентральной стороне мезонефроса (первичной почки) из мезотелия. Со стороны брюшной полости зачатки гонад покрыты висцеральным эпителием. Из клеток мезонефральной мезенхимы половых валиков развиваются будущие соединительнотканные и мышечные элементы гонад. Митотически делящиеся в зачатке гонад гоноциты и дифференцирующиеся из них гонии создают пул половых клеток [1, 6, 11, 27].

Эмбриональные стволовые клетки

На ранних стадиях эмбрионального развития человека (как и млекопитающих животных) в эмбрионе возникают примитивные клетки, из которых развиваются все типы клеток взрослого организма. Эти клетки названы эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Если их выделить из эмбриона и культивировать in vitro, они способны самообновляться (самоподдерживаться), продуцировать более дифференцированные дочерние клетки. Последние способны также дифференцироваться в разные типы клеток организма. Когда ЭСК находятся в культуре in vitro, из них возникают стволовые клетки тканей взрослого организма (кроветворные, линия половых клеток, мышечные, нервные, эпидермальные, интестинальные и др.) [4, 8, 15, 17, 20, 33, 35, 41, 44, 45].

В настоящее время выделение и манипулирование с ЭСК животных стало для ряда лабораторий рутинной процедурой исследования [4, 8, 15, 17, 20, 24, 35]. Чтобы поддерживать недифференцированный фенотип ЭСК при культивировании разработано использование клеточного – фидерного слоя. Как правило, в качестве фидерного слоя применяют первичные эмбриональные фибробласты или перевиваемые фибробласты (STO) мыши, митотически инактивированные гамма-излучением. Сохранение плюрипотентности ЭСК мыши в культуре (in vitro) достигается добавлением цитокинов. Клетки фидерного слоя продуцируют фактор/факторы, которые предохраняют дифференцировку и поддерживают пролиферацию ЭСК и их плюрипотентность [8,15,17]. В 1988 г.был изолирован и идентифицирован фактор, способный поддерживать активность фидерного слоя – лейкемию ингибирующий фактор (LIF). При его использовании ЭСК могут поддерживаться в культуре в отсутствии фидерного слоя. ЭСК, поддерживаемые в культуре, имеют тенденцию накапливать анеуплоидные клетки или клетки с иными ХА (3).

СК детерминированы на асимметричное деление клеток, что приводит к формированию одной дифференцированной (прогенитор) дочерней клетки и другой дочерней клетки, которая является еще стволовой клеткой [15, 17, 23].

До настоящего времени имеются трудности четкого определения стволовых клеток и отсутствуют четкие критерии их идентификации [8, 33], также как и высказаны различные мнения о дефинициях тоти- и плюрипотентности ЭСК [8, 35, 38].

Первые два сообщения о выделении ЭСК из внутренней клеточной массы 3,5-дневной бластоцисты мыши появились в 1981 г. [21, 30]. Показано, что ядра клеток эмбрионов мышей теряют способность к тотипотентности в период от двух- до восьмиклеточной стадии [31].

Различают три типа ЭСК:1) ЭСК, полученные из внутренней клеточной массы предимплантационных эмбрионов млекопитающих животных; 2) примордиальные половые клетки эмбриона (ППКЭ) [8, 41]; 3) ЭСК, полученные из эмбриональных карцином млекопитающих животных [8].

Одним из свойств ЭСК является их способность участвовать в образовании разных типов клеток и тканей. При введении ЭСК в эмбрион (в полость на стадии бластоцисты или ранее) они включаются в эмбриональное развитие и могут принимать участие в формировании ряда тканей и органов химерного организма, в том числе – и линии половых клеток. На этой способности ЭСК основан один из методов создания химерных животных [4, 8, 15, 17].

Одним из важных свойств ЭСК является способность к формированию особых клеточных пространственно хаотичных структур (образований) – эмбриоидных тел (ЭТ). ЭТ образуются при определенных условиях культивирования: при удалении из среды фактора ингибиции дифференцировки; при достижении определенной плотности клеток в культуре или при удалении фидерного слоя. В ЭТ нередко формируется полость (подобная таковой желточного мешка). При прикреплении к субстрату клетки ЭТ дифференцируются в различные типы клеток и тканей (крови, мышц, нервов, эпителии). При определенных условиях (подавление иммунитета) введение ЭСК животным приводит к формированию тератом, содержащих элементы различных дифференцированных тканей и СК [8, 15].

Система ЭСК/ЭТ может использоваться для изучения эмбриональной клеточной дифференцировки и нарушения этого процесса.

Разработаны и используются методы переноса ядер ЭСК животных в зрелые энуклеированные яйцеклетки, например путем электрослияния кариопласта с энуклеированным ооцитом [46].Таким образом достигается получение клонированных организмов.

В мире поддерживается несколько десятков стабильных линий ЭСК мыши, сохраняющих многие годы эмбриональный фенотип. Однако сохранение эмбрионального фенотипа является большой проблемой в технологии ЭСК, поскольку зависит от длительности культивирования клеток. Идентифицированы молекулы, которые поддерживают состояние ЭСК [8, 15, 17, 32, 33, 35].

В экспериментах с длительно-культивируемыми ЭСК свиньи, коровы и мыши было установлено, что одним из важных факторов успеха получения ЭСК является стадия преимплантационного развития, на которой выделяют ЭСК[2, 3]. В 1996 году Томсону с коллегами удалось получить 8 плюрипотентных клеточных линий из клеток бластоцисты обезьян. Две из восьми клеточных линий поддерживались в культуре клеток более года. Из этих линий формировались ЭТ при определенной плотности клеток. В отсутствии фидерного слоя при культивировании in vitro клетки дифференцировались в различные типы клеток [44].

Обобщение основных достижений в области ЭСК млекопитающих свидетельствует о перспективности их использования для решения ряда проблем биологии развития, биотехнологии, клеточной и молекулярной биологии, генной терапии. К таким фундаментальным проблемам относятся : проблема дифференцировки и морфогенеза в эмбриональном развитии, проблема генетической регуляции развития, механизмы канцерогенеза.

ЭСК широко используются при генном таргетинге (для анализа роли определенных генов в процессе развития, с целью моделирования и корректирования наследственных заболеваний человека), при создании трансгенных животных. ЭСК являются источником тотипотентных ядер при клонировании животных. Отмечают перспективность использования ЭСК при замещении или восстановлении ткани, при генной терапии, при трансплантации ЭСК роговицы глаза, трансплантации эпидермиса и волосяных фолликулов и др.

Создание ЭСК сельскохозяйственных животных имеет большое научное и экономическое значение и многолетний опыт исследований с ЭСК мыши вселяют надежду на успех использования ЭСК в этой области [2–4, 8, 15, 31, 33, 35, 42].

Использование ППКЭ является перспективным для решения многих фундаментальных и практических проблем, но пока технически трудно выполнимым (ИПС). Отмечается высокий риск аномалии развития реконструированной яйцеклетки, поскольку не исключена вероятность нарушения репрограммирования генома после введения в нее ядра соматической клетки [8, 41].

Накопленный опыт и определенные успехи фундаментального характера, достигнутые при работе с ЭСК млекопитающих животных делают возможным проанализировать достижения и недоработки в технологии ЭСК с целью использования ЭСК человека или отказа от этого направления по этическим соображениям.

В ноябре 1998 года было опубликовано два сообщения о выделении ЭСК от эмбрионов и плодов человека [41, 45].

В одном из них [45] излагались результаты получения длительно поддерживаемых in vitro плюрипотентных ЭСК, выделенных из клеток ВКМ доимплантационных эмбрионов человека. Эти эмбрионы не были созданы специально для исследований. Их биологические родители дали согласие на их использование в исследованиях, поскольку эмбрионы остались незатребованными для терапии бесплодия и должны были по истечении срока криоконсервирования быть разрушенными [45]. Эти клеточные линии in vivo и in vitro могли дифференцироваться в различные типы клеток и тканей (производных от эктодермы, энтодермы и мезодермы). На их поверхности были идентифицированы маркеры, характерные для ЭСК. Из четырех линий клеток, трансплантированных мышам с супрессией иммунитета, развились тератомы [45].

Во втором сообщении излагалась информация о выделении ЭСК из области гонадного валика и мезентерия 5–8-недельных эмбрионов и плодов, полученных при искусственном прерывании беременности и использованных в исследовании с согласия родителей [41]. По пяти иммунологическим маркерам и положительной реакции клеток на щелочную фосфатазу они были охарактеризованы как ЭСК и ППКЭ. Многие из ППКЭ прошли 20–25 пассажей. Анализ сформированных ЭТ позволил установить, что клетки, произошедшие от ППКЭ, могли дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков [41].

Этические аспекты ТЭСК

Эти две работы вызвали широкие дискуссии не только среди биологов и медиков, но и среди правоведов, социологов, теологов, философов.

Подчеркивают, что получение ЭСК от эмбриона человека не может быть этически оправданным, т.к. при этом разрушается эмбрион. А разрушение человеческой жизни во имя прогресса медицины должно быть запрещено. В Конвенции о правах человека и биомедицине (1996, Совет Европы) в статье 18 п.2 говорится: “Запрещается создание эмбрионов человека в исследовательских целях” [18]. Томсон с коллегами [45] использовал эмбрионы, сформированные при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) для терапевтических целей, незатребованные для донора (доноров гамет) и переданные с их согласия исследователям. Они предназначались для разрушения. Герхарт с коллегами [41] использовал клетки эмбрионов и плодов после медицинских абортов (с согласия доноров). Т.е. источники получения ЭСК в этих работах – разные. Обсуждают следующие проблемы. Что является морально более оправданным? Разрешать, чтобы невостребованные эмбрионы были разрушены или были использованы для исследований и/или для лечения, что может принести пользу больным людям?

Известна максима: абсолютно незащищенный нуждается в абсолютной защите.

Согласно Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964; Токио,1975) и Конвенции о правах человека и биомедицины (Страсбург,1996; Овьедо,1997) [18], – “Интересы и благо отдельного человека должны превалировать над интересами общества и науки”(статья 2).

Статья 18. “Исследования на эмбрионах, проводимые in vitro”: 1. В случаях, когда закон разрешает проведение исследований на эмбрионах in vitro, законом же должна быть предусмотрена адекватная защита эмбрионов. 2. Запрещается создание эмбрионов человека в исследовательских целях [18].

Появляются доказательства, что не обязательно для лечения заболевания получать ЭСК, разрушая эмбрион человека [19, 20, 22, 24, 29, 35, 37, 38, 40, 43].

Выделение стволовых клеток рожденного организма (без нанесения вреда последнему) может быть выполнено для решения ряда теоретических и практических задач в технологии ЭСК: для лечения онкозаболеваний, нарушений иммунной системы, заболеваний крови, мышц, кожи и др. Например, в настоящее время расширяются исследования, опубликованы сообщения о клиническом использовании и создании банков стволовых клеток гемопоэза, выделенных из пуповины, что является этически приемлемым и перспективным. Разрабатываются иные альтернативные пути получения стволовых клеток человека [19, 20, 22, 24, 29, 40].

В одном из разделов Доклада Национального института здоровья (НИЗ) США поддерживается идея о том, что ЭСК человека можно получать при партеногенетическом создании большого количества бластоцист от активированных, но не оплодотворенных ооцитов человека (т.е. не эмбрионов) или иными методами биотехнологии [38].

Ряд стран (Италия, Германия) ввели запрет на проведение исследований с эмбрионами человека. Франция рекомендует относиться с уважением к эмбриону от момента его зачатия; легальные права имеет плод при рождении, т.е. – запрет de facto. В Великобритании, Канаде и Австралии не запрещено создание эмбрионов для исследовательских целей, но разработана система регулирования и контроля последних при функционировании соответствующих законодательных актов. В США соответствующие исследования проводятся в частном секторе, так как Конгресс запрещает использовать федеральные средства на подобные исследования.

Перспективы для терапии с использованием ЭСК человека рассматривают как новую эру в трансплантации и клеточной терапии и это обязывает страны провести ревизию исследований на эмбрионах человека. Изложенная ситуация побудила Государственный совет Франции и НИЗ США обсуждать этот вопрос. Обе страны пришли к одинаковому заключению о том, что такие исследования должны быть ограничены лишь эмбрионами, неиспользованными при ЭКО, которые все равно должны были бы быть разрушены (только с согласия их “владельцев”).

Это является широкой и прагматической позицией. Какую бы крайнюю или умеренную позицию не занимали участники обсуждения вопроса о судьбе неиспользованных эмбрионов, о разрушении эмбрионов человека (как незатребованных для терапии бесплодия) или использовании их, в том числе для решения проблем ЭСК человека, имеется определенная разница между созданием эмбриона специально для исследований и выполнением исследований на эмбрионе, предназначенном для разрушения в любом случае. Более того, который из следующих вопросов этически корректнее: разрешать неиспользованным эмбрионам быть разрушенными или использовать их для исследований, полезных для больных людей?

НИЗ США в новом руководстве делает попытки дать различия между производными клеток от эмбрионов, исследования на которых правительство США запретило поддерживать и исследованиями на клетках, однажды выделенных и которые (исследования) будут финансироваться. По предлагаемым правилам, СК могут быть получены только от невостребованных криоконсервированных эмбрионов человека после завершения программы ЭКО-ПЭ для данной пары. “Это будет путь гарантии разделения ситуаций между созданием эмбриона и решением передать эмбрион для исследований”, – сказала Лэйна Скирболл, директор научной полиции НИЗ США. Врачи, участвующие в выполнении программ ЭКО, не смогут быть избранными в фонд НИЗ США по исследованию на ЭСК.

Таким образом, в США, Франции, Канаде, Австралии обсуждают законодательство, согласно которому будут разрешены исследования на эмбрионах человека, только невостребованных после ЭКО; исследования ЭСК на таких эмбрионах, получение СК только от криоконсервированных и невостребованных (т.е. переданных осознанно их “владельцами”) эмбрионов человека, при соблюдении соответствующего регулирования.

Руководства и принципы по выполнению исследований на ex utero предимплантационных эмбрионах человека, как и проблема определения статуса эмбриона человека [16, 25–28, 36, 38] детально обсуждаются Европейской группой по этике в науке и в новых технологиях Европейской комиссии [37]; рабочими группами Руководящего комитета по биоэтике в Совете Европы, создающими дополнительные протоколы к Конвенции о правах человека и биомедицине [28, 36, 39].

Перспективы использования ЭСК человека рассматривают как новую эру в трансплантации и клеточной терапии и это обязывает страны провести ревизию исследований на эмбрионах человека. Рекомендуют разрешение исследований СК при строгих условиях. Исследования могут быть разрешены только на неиспользованных эмбрионах. Имплантация экспериментальных эмбрионов для получения детей должна быть запрещена.

Однако лишь при осознании специалистами и обществом необходимости ограничения определенных исследований; понимании того, что прогресс в обретении новых биомедицинских знаний не является абсолютной целью; создании действенной информативной системы оценки последствий использования новых достижений науки, не столько ретроспективной оценки, сколько профилактической ; регулирования научной деятельности со стороны общества, закона и морали возможно соблюдение норм научной рациональности, развитие функционирующей системы сохранения морали общества, охраны среды обитания [4–7, 10, 12–14, 18, 25–28, 36–39, 43]. Необходимо сузить рамки морали и соблюдать основной тезис медицины – «не навреди».

Материалы подготовлены при финансовой поддержке РФФИ Проект №00-06-80013

Л.Ф.Курило
НИИ клинической генетики Медико-генетического научного центра РАМН, Москва

Источник

Как сделать нейрон из фибробласта?

Как сделать нейрон из фибробласта?

Индуцированные нейрональные стволовые клетки, полученные трансдифференцировкой фибробластов человека, дифференцируются в нейроны in vitro. Окраска на маркеры нейронов: β-тубулин класса 3 (зелёный) и MAP2 (красный).

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Клеточная терапия в будущем может стать распространённым методом лечения различных заболеваний. В идеале для терапии нужно использовать собственные клетки пациента, чтобы избежать иммунного ответа. Эта статья посвящена современным методам изменения судьбы клетки и перспективам их использования в клеточной терапии.

Конкурс «био/мол/текст»-2013

Эта статья представлена на конкурс научно-популярных работ «био/мол/текст»-2013 в номинации «Лучшее новостное сообщение».

Спонсор конкурса — дальновидная компания Thermo Fisher Scientific. Спонсор приза зрительских симпатий — фирма Helicon.

Клеточная терапия — одно из наиболее перспективных направлений медицины. Замещение поврежденных или не функционирующих клеток может стать методом лечения болезней, на сегодняшний день считающихся неизлечимыми. В целом клеточную терапию можно разделить на несколько направлений: трансплантация клеток-предшественников, взрослых стволовых клеток, трансплантация дифференцированных клеток, готовых к выполнению своих функций, и трансплантация генетически модифицированных клеток с исправленными дефектами. Сейчас использование клеточной терапии в практике ограничивается переливанием крови и трансплантацией костного мозга.

Для широкого применения клеточной терапии в лечении заболеваний необходимо решить несколько проблем. Во-первых, введение чужеродного клеточного материала вызывает иммунологическое отторжение. При переливании крови следят за совместимостью группы крови и резус-фактора донора и пациента. При пересадке органов и костного мозга приходится учитывать совпадение антигенов главного комплекса гистосовместимости, что существенно ограничивает возможность вовремя найти донора. И даже при использовании «совместимого» материала реципиенты вынуждены принимать иммунодепрессанты в течение всей жизни.

Во-вторых, возможность получить клетки донора физически ограничена — доступны лишь некоторые клеточные типы — например, клетки костного мозга, но доступное количество даже этих клеток может быть недостаточным для лечения. Если же говорить про нейроны, гепатоциты и другие специализированные клетки, то их практически невозможно получить. В-третьих, дифференцированные клетки взрослого организма чаще всего уже неспособны к делению, находятся в своей клеточной нише и непригодны для пересадки.

Заболевания нервной системы, связанные с нарушением функционирования и гибелью нейронов, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона, в настоящее время не поддаются лечению. Рассеянный склероз — болезнь, связанная с демиелинизацией аксонов в центральной и периферической нервной системе, также неизлечима. В то же время известно, что, например, признаком болезни Паркинсона является гибель дофаминергических нейронов в черной субстанции среднего мозга, а при рассеянном склерозе выработку миелина прекращают олигодендроциты. Клеточная терапия и трансплантация функциональных нейральных клеток могут быть перспективным подходом для лечения таких заболеваний.

Ниже будут рассмотрены различные способы получения нейральных клеток для клеточной терапии, перспективы применения и имеющиеся проблемы.

Клеточная судьба, и как ее изменить

Всё разнообразие типов клеток в нормальном развитии — нейроны, клетки кожи, крови, печени и другие — формируется в результате деления и дифференцировки одной клетки — зиготы. Зигота образуется при слиянии гамет — ооцита и сперматозоида. Затем в результате клеточного деления формируется группа клеток — морула. Далее образуется полость — бластоцель; эта стадия эмбрионального развития называется бластоцистой. Наружные клетки — трофобласт — будут участвовать в имплантации и формировании плаценты, а из внутренней клеточной массы разовьются все типы клеток эмбриона. Эмбриональное развитие можно представить как дерево, в основе которого лежит одна клетка (зигота), а ветви, отходящие от ствола, символизируют последовательную дифференцировку клеток. Аналогия со стволом удобна еще и тем, что из клеток внутренней клеточной массы получают эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, о которых пойдет речь дальше. Клетки внутренней клеточной массы — недифференцированные: они способны стать клетками любого типа. Каждое ветвление дерева — выбор судьбы в процессе дифференцировки, специализация клеток и сужение спектра дифференцировки. Сначала происходит разделение на три зародышевых листка — эндодерму, мезодерму и эктодерму. Можно дополнительно выделить зародышевый путь, будущие гаметы. Очень схематично дальнейшее развитие можно представить как формирование клеток таких органов как почки, лёгкие, желудок из энтодермы; мышц, сердца, селезенки, крови — из мезодермы; нервной системы и эпидермиса — из эктодермы. Способность к делению и дифференцировке в клетки — производные трех зародышевых листков — называется плюрипотентностью. Программа развития осуществляется путем последовательной активации различных групп транскрипционных факторов, которые регулируют экспрессию множества генов. На экспрессию генов влияют как внутренние факторы, так и внешние сигналы, например получаемые от окружающих клеток. Поддержание жизнедеятельности органов и тканей осуществляют взрослые стволовые клетки. Различные типы стволовых клеток уже были рассмотрены на «биомолекуле»: «Ствол и ветки: стволовые клетки» [1].

В экспериментальных системах и в некоторых случаях в нормальном развитии возможно изменение судьбы клеток (рис. 1). Если дифференцировка — превращение недифференцированной клетки в дифференцированную, то обратный процесс называется дедифференцировкой. Превращение одного предшественника клеток в другой — трансдетерминация. Например, в процессе кроветворения гемопоэтические стволовые клетки дифференцируются в предшественников лимфоидного ряда (лимфоцитов и др.) и миелоидного ряда (гранулоциты, макрофаги, эритроциты и др.). Оказалось, что в экспериментальной системе можно вызвать трансдетерминацию — с помощью экспрессии транскрипционных факторов изменить судьбы предшественников миелоидного ряда так, что они дифференцируются в предшественников гранулоцитов и макрофагов, или, в другом эксперименте, в предшественники эритроцитов [2]. И, наконец, недавно была показана прямая дифференцировка — эмбриональные стволовые клетки можно напрямую дифференцировать в нейроны в результате экспрессии определенных транскрипционных факторов. Прямой такая дифференцировка названа из-за того, что обязательные в нормальном развитии стадии дифференцировки в этом случае отсутствуют. Наконец, превращение дифференцированной клетки одного типа в другой без прохождения стадий дедифференцировки — трансдифференцировка.

Рисунок 1. Различные пути изменения судьбы клетки. Нормальное развитие — дифференцировка тотипотентной зиготы в различные типы клеток с постепенным сужением потенциала к дифференцировке. В эксперименте можно изменить судьбу клетки — вызвать дедифференцировку, трансдетерминацию или прямую дифференцировку.

Все вышеописанные способы изменения судьбы клетки потенциально пригодны для использования в клеточной терапии. Ниже будут рассмотрены возможности применения этих подходов с акцентом на получении нейральных клеток и использовании относительно нового направления в исследованиях, трансдифференцировки.

Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в нейроны

Клетки внутренней массы бластоцисты в процессе нормального развития дифференцируются во все типы клеток взрослого организма. Оказалось, что эти клетки можно выделить in vitro и размножить в практически неограниченном количестве. Недифференцированные клетки в культуре, способные к неограниченному размножению и в определенных условиях к дифференцировке в специализированные типы клеток, были названы «эмбриональными стволовыми клетками». Впервые ЭС клетки были получены Эвансом и Кауфманом из бластоцист мыши [3]. В 1998 году Томсон получил ЭС клетки человека [4]. Появление плюрипотентных ЭС клеток открыло новые перспективы клеточной терапии. Исследователи смогли получить путем дифференцировки ЭС клеток в различные типы клеток, в том числе и нейроны.

Следует отметить некоторые проблемы, связанные с применением ЭС клеток в медицине. Некоторые люди считают неэтичным разрушение эмбрионов человека даже на такой ранней стадии развития как бластоциста. Недавно было показано, что линии эмбриональных стволовых клеток можно получать и без разрушения эмбриона — из отдельных бластомеров, однако процедура изъятия бластомера может быть не совсем безопасной [5]. В том числе из-за этических проблем число полученных линий ЭС клеток невелико. Это затрудняет использование полученных из ЭС клеток дифференцированных производных в клеточной терапии. Среди небольшого числа линий клеток сложно найти сходные по главному комплексу гистосовместимости, а значит, для большинства пациентов не удастся подобрать иммунологически совместимые трансплантируемые клетки.

Терапевтическое клонирование

Для клеточной терапии желательно использовать пациент-специфические клетки. В идеале это должны быть клетки самого пациента — тогда можно не опасаться иммунологического отторжения. И, конечно же, хотелось бы иметь собственные плюрипотентные клетки для каждого пациента, чтобы иметь возможность получения максимально возможного спектра дифференцированных клеток. Долгое время считалось, что стадия плюрипотентных клеток проходится в раннем эмбриональном развитии и возвращение в прошлое невозможно. Однако Джон Гёрдон показал, что это не совсем так. Оказалось, что если из ооцита лягушки убрать ядро (то есть энуклеировать) и подсадить ядро дифференцированной клетки, можно получить взрослое животное [6]. Это означает, что процесс развития можно обратить назад, вызвав дедифференцировку. Метод переноса ядра дифференцированной клетки в цитоплазму энуклеированного ооцита чаще всего не совсем корректно называют «клонированием». Впервые метод клонирования был успешно применен на млекопитающих в 1997 году, когда была получена овца Долли [7]. Затем были клонированы многие виды млекопитающих. Эффективность клонирования в большинстве случаев менее одного процента, а большинство клонированных животных имеют различные проблемы в развитии.

Помимо возможности создания «копий» животных клонирование потенциально открывает ещё одно перспективное направление. Конечно, клонирование человека недопустимо по этическим соображениям, в том числе и из-за ожидаемых нарушений в функционировании генома [8]. А что если остановиться на раннем этапе эмбрионального развития клона и получить плюрипотентные ЭС клетки из бластоцисты? Получение ЭС клеток путем клонирования было названо терапевтическим клонированием (рис. 2). В теории терапевтическое клонирование позволяет решить проблему получения пациент-специфических клеток. Однако для этого метода также есть ограничения. Впервые ЭС клетки человека удалось получить путем клонирования в 2013 году [9]. Несмотря на достаточно высокую эффективность клонирования, для получения ЭС клеток нужны ооциты высокого качества, а значит, для получения даже одной линии ЭС клеток необходимо использовать много ооцитов. А это, в свою очередь, вызывает морально-этические проблемы. Кроме того, при клонировании ЭС клетки будут иметь митохондрии донора ооцитов. Это может быть плюсом для лечения заболеваний, связанных с мутациями митохондриального генома, но, возможно, другой гаплотип митохондриальной ДНК будет вызывать иммунный ответ. Недавние исследования позволили обойти необходимость использования ооцитов донора для индукции плюрипотентности.

Рисунок 2. Методы изменения судьбы клетки для клеточной терапии. Получение плюрипотентных клеток с последующей дифференцировкой и трансдифференцировка позволяют получить нейроны из фибробластов.

Индуцированная плюрипотентность

Эксперименты по клонированию показали возможность дедифференцировки специализированных клеток. Считается, что цитоплазма ооцита содержит некие репрограммирующие факторы, которые могут изменить функционирование генома дифференцированной клетки и вернуть в плюрипотентное состояние. По-видимому, это какие-то транскрипционные факторы, необходимые для осуществления программы развития. На сегодняшний день неизвестно, какие факторы ооцита обладают репрограммирующей активностью и сколько их. Можно только предположить, что это многокомпонентная система с большим количеством факторов.

Возможность репрограммирования генома дифференцированной клетки при клонировании заинтересовала японского исследователя Синъя Яманака. Если найти репрограммирующие факторы ооцита не удаётся, может быть, можно попробовать подобрать их «с чистого листа»? Яманака установил, что для изменения клеточной судьбы необходимо лишь четыре транскрипционных фактора: Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc [10], [11]. Полученные клетки по своим свойствам практически полностью соответствовали ЭС клетками и были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК) (Рис. 2). Уже через год после первой публикации были получены ИПСК человека [12], [13]. В дальнейшем была показана возможность изменения судьбы не только эмбриональных, но и полученных из кожи фибробластов взрослого человека, а также других типов клеток. В 2012 году Джон Гёрдон и Синъя Яманака получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие возможности репрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные [14].

Таким образом, в настоящее время есть возможность получения пациент-специфических плюрипотентных клеток из клеток кожи. ИПСК практически не отличаются по своим свойствам от ЭС клеток и в то же время их получение не связано с этическими запретами. Как и ЭС клетки, ИПСК можно дифференцировать во многие типы клеток, в том числе нейроны. Казалось бы, технология создания пациент-специфическихплюрипотентных клеток позволит уже завтра использовать клеточную терапию, однако нерешенные проблемы еще остались.

Дифференцировка плюрипотентных клеток in vitro — крайне неэффективный процесс. Хотим ли мы получить из ЭС клеток или ИПСК нейроны, кроветворные клетки или же кардиомиоциты, лишь незначительный процент исходных клеток будет соответствовать ожидаемому типу клеток. Дифференцировка in vitro имитирует нормальный процесс дифференцировки in vivo, наши знания о котором ограничены. Кроме того, при дифференцировке in vitro мы можем добавлять в среду для культивирования различные ростовые факторы, но в большинстве случаев не можем смоделировать клеточное окружение. А ведь для правильной дифференцировки необходимы сигналы окружающих клеток, которые, в свою очередь, зависят от взаимодействия многих типов клеток. Таким образом, даже получив нужную популяцию клеток, мы не можем быть полностью уверены в том, что дифференцировка прошла правильно. Проверить это можно, сравнив профили экспрессии генов в норме и в полученном в результате дифференцировки типе клеток и проверив их функциональность. Такая проверка, конечно, проводится на модельных животных, а не на человеке, и не всегда понятно, можно ли считать, что клетки, доказавшие выполнение своей специализированной функции на модельных животных, будут корректно функционировать в организме человека.

Еще одна проблема — потенциальная онкогенность плюрипотентных клеток. Если плюрипотентные клетки ввести в организм без предварительной дифференцировки, они формируют доброкачественную опухоль (тератому), пытаясь обеспечить эмбриональное развитие, несмотря на отсутствие необходимых сигналов. Неполностью дифференцированные производных плюрипотентных клеток также опасны, поэтому необходимо очень тщательно отделять прошедшие дифференцировку клетки от сохранивших потенциал к развитию. Кроме того, сам процесс репрограммирования может вызывать появление генетических и эпигенетических нарушений [15]. Один из подходов, позволяющих обойти проблему онкогенности, представлен ниже.

Трансдифференцировка: нейрон из фибробласта

После того, как были получены ИПСК, стало ясно, что для изменения судьбы клетки может хватить всего лишь нескольких транскрипционных факторов. Дальнейшее развитие технологии позволило получить ИПСК без интеграции трансгенов доставкой репрограммирующих факторов с помощью модифицированной РНК, безъинтеграционными вирусами или, в недавней работе, с использованием для репрограммирования только набора химических веществ [16]. Таким образом, проблема инсерционного мутагенеза практически решена, однако индукция плюрипотентности увеличивает и онкогенный потенциал клеток. Может быть, можно обойтись без шага индуцированной плюрипотентности и сразу получать желаемый тип клеток?

Многие исследователи сосредоточили свое внимание на получении нейронов с использованием фибробластов в качестве исходного материала для трансдифференцировки. Выбор фибробластов как для дедифференцировки, так и для трансдифференцировки не случаен. Фибробласты — относительно гомогенная популяция клеток, их можно легко получить из взрослого организма, взяв небольшой кусочек кожи и размножив in vitro. Для получения нейронов был использован тот же методический подход, что и для ИПСК. Были отобраны 19 транскрипционных факторов, экспрессия которых выявлена в нейронах, сделаны лентивирусные векторы, несущие гены транскрипционных факторов, и проведено заражение фибробластов мыши. Получив клетки, имеющие маркеры нейронов, исследователи постепенно установили минимальный необходимый набор репрограммирующих факторов: Ascl1, Brn2 и Mytl1 [17]. Полученные нейроны обладали способностью формировать синапсы, а эффективность их получения достигала 19,5%. Нужно отметить, что в этих экспериментах была получена смесь нейронов нескольких типов, то есть такие нейроны пока непригодны для клеточной терапии. В дальнейшем, аналогичным методом были получены нейроны из фибробластов человека, в том числе моторные и дофаминергические нейроны. Одна из проблем этого метода — в большинстве работ эффективность получения нейронов не превышает нескольких процентов, что не дает получить их в достаточном количестве. Но эту проблему решает следующая модификация метода.

Нейральные стволовые клетки из фибробластов

Итак, получение нейронов из фибробластов ограничено количеством фибробластов. Кроме того, использование функциональных нейронов для клеточной терапии затруднительно — нейроны формируют многочисленные отростки, и их уже не удается пересадить без гибели клеток, так как отростки при этом разрушаются. А что, если получать не функциональные нейроны, а нейрональные стволовые клетки? Эти клетки обладают потенциалом как к делению, так и к дифференцировке в основные нейральные типы клеток: нейроны, глию и олигодендроглию. И действительно, было показано, что экспрессия всего одного транскрипционного фактора — Sox2 — позволяет получить и затем размножить in vitro нейрональные стволовые клетки, а при их дифференцировке — нейрональные клеточные типы [18]. По-видимому, именно получение нейрональных стволовых клеток — будущее клеточной терапии.

Проблемы клеточной терапии заболеваний нервной системы

Несмотря на развитие клеточных технологий, остается множество нерешенных проблем. Общая проблема клеточной терапии — отторжение трансплантированного материала иммунной системой. Одно из решений — использование клеток самого пациента после дедифференцировки или трансдифференцировки. Для терапии заболеваний центральной нервной системы пациент-специфические клетки могут и не потребоваться. Мозг является иммунопривилегированным органом, что позволяет трансплантировать клетки, не учитывая гистосовместимость. Следующая проблема связана с выбором клеток для трансплантации. Допустим, in vitro получены дофаминергические нейроны для лечения болезни Паркинсона. При переносе функциональных нейронов клетки, скорее всего, погибнут из-за поломки отростков. Возможное решение — трансплантация клеток-предшественников, которые пройдут последние стадии дифференцировки уже «на месте».

Трансплантация нейрональных клеток в мозг имеет и другие подводные камни. Не совсем понятно, сколько введенных клеток выживет после переноса. Кроме того, они трансплантируются в систему, в которой связи между клетками уже сформированы. Смогут ли введенные нейроны сформировать новые связи с окружением и корректно функционировать в этой системе? Также, остается проблема возможной онкогенности вводимых клеток.

И, тем не менее, в настоящее время клеточная терапия всё ближе продвигается к практическому применению. Современные клеточные технологии позволяет получать многие типы клеток и даже органы in vitro. Так, из плюрипотентных клеток мыши в 3D культуре было выращено внутреннее ухо [19] и аналог глазного бокала [20]. Эксперименты на модельных животных показывают принципиальную возможность использования клеточной терапии для лечения некоторых заболеваний. Однако для широкого применения новых технологий в медицине необходимо решить большое количество этических и методических проблем.

Источник