Что такое диализат биохимия

Диализ белков: концентрирование и обессоливание. Обзор

Диализ — процесс разделения молекул в растворе по разности их скоростей диффузии через полупроницаемую мембрану. После многократной замены внешнего раствора состав среды по обеим сторонам от мембраны (концентрация солей, pH) будет тот же, что и в окружающем растворе.

Это распространенный метод, который применяется для удаления нежелательных небольших молекул (солей, красителей и др.), из более крупных макромолекул (белков, ДНК, полисахаридов).

Диализ используется для обессоливания, удаления меченых реагентов, низкомолекулярных примесей, исследования связывания активной фармсубстанции, изучения клеток, очистки вирусов, обработки крови.

Продукция Thermo FS для диализа даёт возможность работать с образцами в широком диапазоне объёмов от 10 мкл до 250 мл. Специальные диализные ёмкости не требуют применения клипс и других дополнительных приспособлений, что позволяет сэкономить время, избегать потерь или загрязнений образца и процесс простым.

Продукты снабжены MWCO-мембраной (Molecular Weight Cut-Off), предназначенной для диализа молекул с молекулярным весом до 2; 3,5; 7; 10 или 20 кДа.

Выбор подходящего продукта определяется, в большей степени, объемом и молекулярным весом (MWCO).

Наличие у типов продуктов для диализа позиций с различными MWCO-мембранами

Планшет и вставки (10-100 мкл)

Применяются для быстрой одновременной обработки нескольких образцов небольшого объема (до 96 образцов по 10-100 мкл). Диализ может быть проведен за 2-4 часа с выходом продукта более 90%.

Вставки имеют два варианта заказа по MWCO – 3.5K и 10K.

Ёмкости (10-2000 мкл)

Представляют собой полипропиленовые стаканчики со встроенной мембраной. Различаются по объему (до 2 мл) и MWCO. Вставляются в обычные центрифужные пробирки на 1,5; 15 и 50 мл (заказываются отдельно). Диализ происходит за 15 мин с выходом продукта боле 95%.

Кассеты (0,1-70 мл)

Обеспечивают простое и эффективное удаление буферных солей и мелких загрязнений образцов объемом от 0,1 мл до 30 мл (до 70 мл у кассет типа G2). После добавления образца в кассету её помещают в сосуд с буфером. Поплавок на верхней части кассеты обеспечивает плавучесть.

У кассет типа G2 конструкция позволяет загружать образец обычной пипеткой.

Колбы (150-250 мл)

Пригодны для работы с образцами объемом от 150 до 250 мл. Обеспечивают простое и эффективное удаление буферных солей и мелких загрязнений. Образцы могут быть легко добавлены и удалены пипеткой или путем прямой заливки через широкое отверстие в верхней крышке колбы. После чего колба помещается в сосуд с буфером. Поплавок на горлышке колбы обеспечивает плавучесть.

Мешки (15-100 мл)

Мешки (трубки) для диализа представляют собой трубочки из регенерированной целлюлозы. Концы фиксируются с помощью специальных зажимов (заказываются отдельно). Отличаются объёмом вмещаемого образца (до 100 мл), диаметром и MWCO. Диализ может быть проведен за 4 – 6 часов с выходом продукта более 90%.

Цветовая кодировка по MWCO

Для удобства пользователей производителем разработана специальная цветовая кодировка всех типов продуктов для диализа в зависимости от значения MWCO.

MWCO / Тип продукта

Замена буферного раствора

Замена буферного раствора — важный этап при подготовке образцов биологических проб, такая процедура выполняется для подготовки образцов перед выделением целевого компонента или перед последующим длительным хранением пробы. При использовании диализных кассет, мешков и других ёмкостей, необходимо достаточно большое количество буфера и затрат времени. Использование центрифужных концентраторов Vivaspin20 совместно с диализными вставками VSA005 (Sartorius) позволяют ускорить этот процесс с затратой меньшего количества буфера и эффективно проводить одновременно его обессоливание и концентрирование.

Одновременно с этим при концентрировании белков, склонных к преципитации при повышенном содержании солей, необходимо дольше их поддерживать в растворенном состоянии. Использование концентраторов с диализными вставками позволяет проводить постепенную градиентную замену буфера и более эффективно понижает концентрацию солей. А так как замена буфера при таком способе происходит значительно быстрее, целевые белки в большей степени защищены от действия протеаз.

Источник

Диализное лечение пациентов при остром повреждении почек, программный гемодиализ пациентов при хронической болезни почек, перитонеальный диализ пациентов при хронической болезни почек

Общая информация

Краткое описание

Приложение к приказу
Министерства здравоохранения
Республики Беларусь 18.07.2013 №806

КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОТОКОЛЫ
диализного лечения пациентов при остром повреждении почек,
программного гемодиализа пациентов при хронической болезни почек
перитонеального диализа пациентов при хронической болезни почек

1. Настоящие клинические протоколы диализного лечения пациентов при острой и хронической почечной недостаточности определяют требования к процессу оказания медицинской помощи населению в амбулаторных и стационарных условиях районных (далее- РУ), межрайонных (далее-МУ), городских (далее- ГУ), областных (далее- ОУ) и республиканских (далее-Респ.У) организаций здравоохранения Республики Беларусь.
Пациенты с острым изолированным повреждением почек, стабильной гемодинамикой при отсутствии системных осложнений получают диализную терапию в типовых отделениях гемодиализа. Лица с комбинированными формами острой почечной недостаточности должны сразу направляться в отделения реанимации всех уровней, где имеется специальная аппаратура, в том числе и для проведения диализотерапии в медленно поточном варианте и продленных/непрерывных режимах. После стабилизации их клинического статуса и необходимости продолжения стандартных прерывистых сеансов гемодиализа пациенты продолжают лечение в отделениях гемодиализа.
Пациенты с хронической почечной недостаточностью получают лечение методами диализотерапии в амбулаторных условиях и госпитализируются в специализированный стационар только для диагностики и лечения возникших осложнений.

Лечение

3.Показания для диализотерапии при ОПП
При определении показаний к прекращению консервативного лечения и начала диализотерапии у пациентов с острыми повреждениями почек любого происхождения следует пользоваться критериями современной международной классификации RIFLE, представленной в таблице 1.

Стратификация стадий 01111 по классификации RIFLE

Показания к проведению методов почечно-заместительной терапии при 01111

9. Выбор диализирующего раствора
У большинства «стабильных» пациентов с 01111, требующих заместительной почечной терапии, применяется диализирующий раствор стандартного состава, который готовится из концентрата промышленного или собственного производства. В зависимости от складывающейся конкретной ситуации этот стандартный состав может быть изменен. В таблице 4 приведены некоторые варианты композиции диализирующего раствора для лечения ОПП.

10. Лабораторный контроль течения ОПП при гемодиализе

Сроки начала восстановления деятельности почек непредсказуемы и зависят от причины ОПП, интенсивности и адекватности проведенного лечения. Существуют некоторые лабораторные и клинические предикторы, указывающие на хорошую перспективу полного или даже частичного улучшения как парциальных, так и суммарных функций почек. В этой связи важное значение отводится данным биохимического исследования, частота определения которых приведена в таблице 5.
Таблица ориентирует на ежедневную оценку клинико-лабораторных показателей у пациентов с ОПП, получающих стандартный гемодиализ. Некоторые из этих показателей могут исследоваться чаще (например, до и после диализа), хотя особой необходимости в этом нет и достаточно иметь данные результатов анализа утром или утром и вечером, но не сразу после процедуры диализа.
Для правильной оценки эффективности сеанса гемодиализа забор крови для анализа необходимо делать через 10-15 минут после отключения аппаратуры. В этот промежуток времени произойдет выравнивание концентрации метаболитов в циркулирующей крови и тканях, что свидетельствует об истинном эффекте элиминации.

11. Применение перитонеального диализа при Olili
Брюшина является биологической полупроницаемой мембраной и создание условий для диффузии метаболитов и ультрафильтрации жидкости (движение молекул из крови в брюшную полость и наоборот) используется для интракорпорального искусственного очищения крови при острой и хронической почечной недостаточности. Для проведения перитонеального диализа у больного с ОПП требуется:
наличие катетера (дренажа) в полости брюшины для заливания и сливания диализирующего раствора;
наличие стерильных диализирующих растворов промышленного производства различного состава вместе с магистралями;
наличие аппарата-циклера, осуществляющего заполнение и дренаж брюшной по заданной программе полости (не обязательно!);
наличие персонала, владеющего методикой ручного и автоматического (на циклере)перитонеального диализа.

14. Кратность заливки и время экспозиции
Частота замены раствора в брюшной полости является важной составляющей метода перитонеального диализа, т.к. обеспечивает постоянный градиент концентрации метаболитов и токсинов между кровью в капиллярах брюшины и диализатом. Оптимальным временем нахождения диализа в брюшной полости, обеспечивающим максимальный эффект при ОПП, является период 1 час. При этом раствор в объеме 2 л
заливается в течение 10 минут, а сливается за 20 минут. Таким образом, процесс диализа в каждом цикле (экспозиция) продолжается 30 минут, а общий расход диализирующего раствора в сутки составляет 48 л.
Такой режим обмена должен применяться у наиболее тяжелой категории пациентов с гиперазотемией или большой массой тела. У более стабильных пациентов время экспозиции можно увеличивать до 1,5-2 часов с уменьшением расхода диализирующего раствора.
У пациентов с анурией и высоким ЦВД, отеком легких и/или головного мозга необходимо для первых нескольких обменов использовать растворы с высоким содержанием глюкозы, которые обладают максимальной осмолярностью. Следует помнить, что низкий уровень альбумина и глюкозы в крови реанимационных пациентов опасен угрозой гиповолемии вследствие быстрого удаления жидкости из русла циркуляции в брюшную полость.
Кроме того, высокое содержание глюкозы в растворах неблагоприятно отражается на морфологическом состоянии брюшины, т.к. продукты ее деградации нарушают механизмы проницаемости, вызывая фиброз ее стенок. Отрицательной стороной растворов с большим содержанием глюкозы является быстрая ее реабсорбция, что приводит к гипергликемии и ухудшению состояния пациентов, особенно при наличии септицемии. Поэтому через 15-30 минут экспозиции гиперосмолярные растворы требуют слива из брюшной полости и замены на новый объем.

16. Показания для перитонеального диализа при ОПП
Перитонеальный диализ при ОПП является не только альтернативным методом гемодиализу, но иногда и единственной возможностью спасения жизни человека. В этой связи прямыми показаниями для острого перитонеального диализа служат:
пациенты с ОПН при тяжелых травмах внутренних органов; пациенты с внутренними и внутричерепными кровотечениями; послеоперационные пациенты;
пациенты, у которых по любым причинам невозможен сосудистый доступ для гемодиализа;
лица с выраженной сердечной недостаточностью; пациенты с низким и нестабильным артериальным давлением; дети и люди преклонного возраста.

17. Противопоказания для перитонеального диализа при ОПП
Абсолютных противопоказаний для проведения перитонеального диализа у пациентов с ОПН немного, у большинства они носят относительный характер, но, тем не менее, к ним следует отнести:
полостные операции с оставлением дренажей (плевральная и брюшная полости);
динамическая непроходимость или атония кишечника; профузные кровотечения любого происхождения, требующие хирургической остановки;
тяжелая дыхательная недостаточность; массивные спайки брюшной полости; вторая половина беременности;
грыжи передней брюшной стенки или паховых каналов.
Некоторые из указанных противопоказаний устранимы и такие пациенты должны предварительно оцениваться в отношении возможности применения всех методик коррекции с последующим началом перитонеального диализа.

20. Способ введения реинфузата
Замещающий раствор – обязательный компонент гомофильтрации и гемодиафильтрации – представляет собой комбинацию солей, компенсирующий их потерю через полупроницаемую мембрану. Он вводится или из пластиковых контейнеров (ex line) или путем дополнительной очистки диализирующего раствора (on line). Существует две основные точки введения этого раствора. Если он вводится перед гемофильтром (гемодиафильтром), то способ называется предилюцией, а если после него – постдилюцией, которая применяется чаще.
В таблице 7 представлены положительные и отрицальные стороны обоих способов замещения.

Особенности методов введения замещающего раствора

Постдилюция является наиболее распространенным методом замещения, однако, при этом следует помнить, что удаление большого объема жидкости из организма повышает вязкость крови и создает условия для тромбоза капилляров гемофильтра. Для профилактики этого требуется увеличение дозы антикоагулянтов и /или увеличение скорости кровотока до 150-200 мл/мин.
Основным недостатком предилюции является разбавление крови в гемофильтре и клиренс токсических продуктов снижается. Предилюция показана при необходимости удаления большого количества фильтрата (более 25 л/сутки), при исходной гиперкоагуляции или сгущении крови любого происхождения. Предилюция требует увеличения расхода субституата, что экономически невыгодно.

21. Доза медленно поточных процедур при ОПП
Доза или адекватность диализа – тот индивидуально подобранный режим диализотерапии, позволяющий обеспечить медицинскую реабилитацию и физическую активность пациента. Она включает несколько компонентов работы технических средств искусственного очищения крови – характеристику депурационных свойств диализаторов (фильтров) скорость потоков крови и диализирующего раствора, продолжительность процедуры и объем крови, прошедший обработку в массообменных устройствах. На сегодняшний день дозы каждой из медленно поточных процедур для пациентов с ОПП четко не определены, что связавается с индивидуальными особенностями течения почечной недостаточности. Если у больного с ОПП и нестабильной гемодинамикой, но невысоким уровнем катаболизма применяется продленный гемодиализ, то продолжительность сеанса может составлять 6-8 часов при скорости кровотока 100 мл/мин, а диализирующего раствора 1,5-2 л/час.
Если для удаления молекул более крупных, чем мочевина, применяется продленная гемодиафильтрация, то ее продолжительность может составлять 12-24 часа, с удалением до 36 л ультрафильтрата и соответствующим замещением, учитывающим потребление жидкости.
При проведении гемофильтрации с режимом постдилюции у пациентов как с изолированной ОПН, так и при сепсисе наиболее оптимальной рекомендуемой дозой служит 45 мл/кг/час или 68 л/сутки. Проведение гемодиафильтрации в течение 16 часов в сутки со средней дозой 1,5 л/час требуется у более стабильных пациентов весь период анурии. При этом оставшиеся 8 часов отводятся на диагностические процедуры и лечение других осложнений.

22. Преимущества и недостатки медленно поточных процедур при лечении ОПП
Вопросы преимуществ и недостатков продленных и непрерывных методов очищения крови при лечении пациентов с ОПП четко не определены, а результаты лечения зависят от технических возможностей отделения и опыта медицинского персонала. Среди явных положительных сторон выявлены следующие:
благодаря реинфузату (субституату) снижения ОЦП не происходит, и центральная гемодинамика остается стабильной весь срок проведения процедуры;
компенсация минимальных потерь Na сохраняет осмотическое давление крови и поддерживает тонус сосудов;
устойчивость осмотического давления крови и межклеточной жидкости предотвращает отек нервных клеток и сохраняет мозговое кровообращение
постоянство осмоляльности крови уменьшает стимуляцию РАА системы и снижает потребность во введении как вазопрессоров, так и гипотензивных средств.
К недостаткам медленно поточных методов относят:
ниличие специальной аппаратуры и расходных материалов;
проблемы с сосудистым доступом;
высокий риск системных кровотечений;
длительная иммобилизация;
частые проблемы с фильтрами (тромбозы, разрывы мембран);
дорого.

23. Результаты запланированного лечения
Результат лечения пациентов с ОПП зависит от сроков диагностики и времени начала заместительной почечной терапии. При этом следует знать:
при правильной методике и опыте прерывистый гемодиализ, не требующий специальной дорогостоящей аппаратуры, может с успехом применяться и у гемодинамически нестабильных пациентов;
доза диализа несомненно влияет на результат, в связи с чем следует ее максимально увеличить;
медленно поточный ежедневный длительный, но прерывистый гемодиализ на высоко поточных мембранах, является методом выбора у пациентов с ОПН, т.к. включает преимущества медленного потока и переносится лучше, стоимость его ниже, но время для диагностики причин и проведения лечебных вмешательств удлиняется;
методы внепочечного очищения крови, основанные на конвекционном транспорта токсинов, должны широко применяться в реанимационных отделениях для лечения наиболее сложных пациентов с комбинированными формами ОПП.
Исходами лечения ОПП при использовании современных методов диализотерапии могут быть как полное восстановление здоровья, так и восстановление здоровья с частичным улучшением функции почек и переходом нефропатии в хроническую болезнь почек, что в соответствии с классификатором исходов заболеваний относится к кодам 1, 3,4, 8 и 9.

Источник

В биохимия, диализ это процесс разделения молекулы в решение разницей в их скорости распространение через полупроницаемую мембрану, такую ​​как диализная трубка. [1]

Концепция диализа была представлена ​​в 1861 году шотландским химиком Томасом Грэмом. Он использовал эту технику для разделения растворенных веществ сахарозы (малая молекула) и гуммиарабика (большая молекула) в водном растворе. Он назвал диффундирующие растворенные вещества кристаллоидами и те, которые не проходят через мембрану коллоидами. [3]

Исходя из этой концепции, диализ можно определить как процесс самопроизвольного отделения взвешенных коллоидных частиц от растворенных ионов или молекул малых размеров через полупроницаемую мембрану. Чаще всего диализные мембраны изготавливаются из целлюлозы, модифицированной целлюлозы или синтетического полимера (ацетата целлюлозы или нитроцеллюлозы). [4]

Содержание

Принципы диализа

Из-за размера пор мембраны большие молекулы в образце не могут проходить через мембрану, тем самым ограничивая их диффузию из камеры для образца. Напротив, небольшие молекулы будут свободно диффундировать через мембрану и достичь равновесия по всему объему раствора, тем самым изменяя общую концентрацию этих молекул в образце и диализате (см. Диализный рисунок справа). После достижения равновесия конечная концентрация молекул зависит от объемов используемых растворов, и если уравновешенный диализат заменяется (или заменяется) свежим диализатом (см. Процедуру ниже), диффузия еще больше снизит концентрацию малых молекул. в образце.

Диализ можно использовать для введения или удаления небольших молекул из образца, поскольку небольшие молекулы свободно перемещаются через мембрану в обоих направлениях. Это делает диализ полезным методом для множества применений. Видеть диализная трубка для получения дополнительной информации об истории, свойствах и производстве полупроницаемые мембраны используется для диализа.

Наконец, ультрафильтрация, которая представляет собой конвективный поток воды и растворенных веществ вниз по градиенту давления, вызванному гидростатическими или осмотическими силами. При диализе ультрафильтрация удаляет из пробы молекулы отходов и лишние жидкости. [5] [6]

Диффузионный диализ

Электродиализ

Доннан Диализ

Обратный электродиализ

Электро-электродиализ

Процедура диализа

Оборудование

Общий протокол

Типичная процедура диализа образцов белка выглядит следующим образом:

Общий объем образца и диализата определяют конечную равновесную концентрацию малых молекул по обе стороны мембраны. Используя соответствующий объем диализата и многократные замены буфера, можно снизить концентрацию мелких загрязняющих веществ в образце до приемлемого или незначительного уровня. Например, при диализе 1 мл образца против 200 мл диализата концентрация нежелательных диализируемых веществ будет уменьшена в 200 раз при достижении равновесия. После двух дополнительных замен буфера по 200 мл каждая уровень загрязнения в образце снизится в 8 x 10 раз. 6 (200 х 200 х 200).

Оптимизация переменных и протокола

Хотя диализ образца относительно прост, универсальная процедура диализа для всех приложений не может быть предоставлена ​​из-за следующих переменных:

Кроме того, конечная точка диализа в некоторой степени субъективна и зависит от приложения. Следовательно, общая процедура может потребовать оптимизации.

Мембраны для диализа и MWCO

Мембраны для диализа производятся и характеризуются согласно отсечка по молекулярной массе (MWCO) лимиты. В то время как мембраны с MWCO в диапазоне от 1 до 1000000 кДа коммерчески доступны, наиболее часто используются мембраны с MWCO около 10 кДа. MWCO мембраны является результатом количества и среднего размера пор, созданных во время изготовления диализной мембраны. MWCO обычно относится к наименьшей средней молекулярной массе стандартной молекулы, которая не будет эффективно диффундировать через мембрану во время расширенного диализа. Таким образом, диализная мембрана с молекулярной массой 10 кДа обычно удерживает более 90% белка с молекулярной массой не менее 10 кДа. [11] [12]

Важно отметить, что MWCO мембраны не является четко определенной величиной. Молекулы с массой, близкой к пределу MWCO мембраны, будут диффундировать через мембрану медленнее, чем молекулы, значительно меньшие, чем MWCO. Чтобы молекула могла быстро диффундировать через мембрану, она, как правило, должна быть по крайней мере в 20-50 раз меньше, чем рейтинг MWCO мембраны. Следовательно, нецелесообразно отделять белок 30 кДа от белка 10 кДа с помощью диализа через диализную мембрану, рассчитанную на 20 кДа.

Диализные мембраны для лабораторного использования обычно изготавливаются из пленки регенерированной целлюлозы или сложных эфиров целлюлозы. См. Ссылку для обзора целлюлозных мембран и производства. [13]

Форматы лабораторного диализа

Диализ обычно проводят в закрытых пакетах диализных трубок или в различных форматированных диализаторах. Выбор используемой схемы диализа во многом зависит от размера образца и предпочтений пользователя.Трубка диализа это самый старый и, как правило, наименее дорогой формат, используемый для диализа в лаборатории. Трубку разрезают и закрывают зажимом на одном конце, затем заполняют и запечатывают зажимом на другом конце. Трубки обеспечивают гибкость, но вызывают повышенное беспокойство относительно обращения, герметизации и извлечения проб. Трубки для диализа обычно поставляются влажными или сухими в рулонах или складчатых телескопических трубках.

Широкий выбор диализных устройств (или диализаторов) доступен от нескольких поставщиков. Диализаторы предназначены для определенных диапазонов объемов пробы и обеспечивают большую безопасность пробы, а также повышенную простоту использования и производительности при проведении диализных экспериментов по трубкам. Наиболее распространенными предварительно отформатированными диализаторами являются линейки продуктов Slide-A-Lyzer, Float-A-Lyzer и Pur-A-lyzer / D-Tube / GeBAflex Dialyzers.

Поставщики

Приложения

Диализ имеет широкий спектр применения. Их можно разделить на две категории в зависимости от типа используемого диализа.

Диффузионный диализ

Некоторые применения диффузионного диализа объясняются ниже.

Электродиализ

Некоторые применения электродиализа объясняются ниже.

Преимущества и недостатки

У диализа есть не только преимущества, но и недостатки. Следуя структуре предыдущего раздела, обсуждаются плюсы и минусы в зависимости от типа используемого диализа. Преимущества и недостатки как диффузионного диализа, так и электродиализа описаны ниже.

Диффузионный диализ

Основным преимуществом диффузионного диализа является низкое энергопотребление аппарата. Эта мембранная технология работает при нормальном давлении и не имеет изменения состояния, следовательно, требуемая энергия значительно снижается. В то же время это снижает и эксплуатационные расходы. Кроме того, необходимо отметить низкую стоимость установки, простоту эксплуатации, а также стабильность и надежность процесса. Еще один ключевой аспект, поскольку изменение климата в наши дни становится все более и более важным, заключается в том, что диффузионный диализ не загрязняет окружающую среду. [7]

Электродиализ

Основным недостатком электродиализа является ограничение плотности тока, процесс должен проводиться при более низкой плотности тока, чем максимально допустимая. Дело в том, что при приложении определенного напряжения диффузия ионов через мембрану не является линейной, что приводит к диссоциации воды, что снижает эффективность работы. Другой аспект, который следует принять во внимание, заключается в том, что, хотя для работы требуется низкая энергия, чем выше концентрация соли в исходном сырье, тем выше будет необходимая энергия. Наконец, в случае некоторых продуктов необходимо учитывать, что электродиализ не удаляет микроорганизмы и органические загрязнители, поэтому необходима дополнительная обработка. [19]

Источник