Диализ белков: концентрирование и обессоливание. Обзор
Диализ — процесс разделения молекул в растворе по разности их скоростей диффузии через полупроницаемую мембрану. После многократной замены внешнего раствора состав среды по обеим сторонам от мембраны (концентрация солей, pH) будет тот же, что и в окружающем растворе.
Это распространенный метод, который применяется для удаления нежелательных небольших молекул (солей, красителей и др.), из более крупных макромолекул (белков, ДНК, полисахаридов).
Диализ используется для обессоливания, удаления меченых реагентов, низкомолекулярных примесей, исследования связывания активной фармсубстанции, изучения клеток, очистки вирусов, обработки крови.
Продукция Thermo FS для диализа даёт возможность работать с образцами в широком диапазоне объёмов от 10 мкл до 250 мл. Специальные диализные ёмкости не требуют применения клипс и других дополнительных приспособлений, что позволяет сэкономить время, избегать потерь или загрязнений образца и процесс простым.
Продукты снабжены MWCO-мембраной (Molecular Weight Cut-Off), предназначенной для диализа молекул с молекулярным весом до 2; 3,5; 7; 10 или 20 кДа.
Выбор подходящего продукта определяется, в большей степени, объемом и молекулярным весом (MWCO).
Наличие у типов продуктов для диализа позиций с различными MWCO-мембранами
MWCO / Тип продукта
Планшет и вставки (10-100 мкл)
Применяются для быстрой одновременной обработки нескольких образцов небольшого объема (до 96 образцов по 10-100 мкл). Диализ может быть проведен за 2-4 часа с выходом продукта более 90%.
Вставки имеют два варианта заказа по MWCO – 3.5K и 10K.
Ёмкости (10-2000 мкл)
Представляют собой полипропиленовые стаканчики со встроенной мембраной. Различаются по объему (до 2 мл) и MWCO. Вставляются в обычные центрифужные пробирки на 1,5; 15 и 50 мл (заказываются отдельно). Диализ происходит за 15 мин с выходом продукта боле 95%.
Кассеты (0,1-70 мл)
Обеспечивают простое и эффективное удаление буферных солей и мелких загрязнений образцов объемом от 0,1 мл до 30 мл (до 70 мл у кассет типа G2). После добавления образца в кассету её помещают в сосуд с буфером. Поплавок на верхней части кассеты обеспечивает плавучесть.
У кассет типа G2 конструкция позволяет загружать образец обычной пипеткой.
Колбы (150-250 мл)
Пригодны для работы с образцами объемом от 150 до 250 мл. Обеспечивают простое и эффективное удаление буферных солей и мелких загрязнений. Образцы могут быть легко добавлены и удалены пипеткой или путем прямой заливки через широкое отверстие в верхней крышке колбы. После чего колба помещается в сосуд с буфером. Поплавок на горлышке колбы обеспечивает плавучесть.
Мешки (15-100 мл)
Мешки (трубки) для диализа представляют собой трубочки из регенерированной целлюлозы. Концы фиксируются с помощью специальных зажимов (заказываются отдельно). Отличаются объёмом вмещаемого образца (до 100 мл), диаметром и MWCO. Диализ может быть проведен за 4 – 6 часов с выходом продукта более 90%.
Цветовая кодировка по MWCO
Для удобства пользователей производителем разработана специальная цветовая кодировка всех типов продуктов для диализа в зависимости от значения MWCO.
Замена буферного раствора
Замена буферного раствора — важный этап при подготовке образцов биологических проб, такая процедура выполняется для подготовки образцов перед выделением целевого компонента или перед последующим длительным хранением пробы. При использовании диализных кассет, мешков и других ёмкостей, необходимо достаточно большое количество буфера и затрат времени. Использование центрифужных концентраторов Vivaspin20 совместно с диализными вставками VSA005 (Sartorius) позволяют ускорить этот процесс с затратой меньшего количества буфера и эффективно проводить одновременно его обессоливание и концентрирование.
Одновременно с этим при концентрировании белков, склонных к преципитации при повышенном содержании солей, необходимо дольше их поддерживать в растворенном состоянии. Использование концентраторов с диализными вставками позволяет проводить постепенную градиентную замену буфера и более эффективно понижает концентрацию солей. А так как замена буфера при таком способе происходит значительно быстрее, целевые белки в большей степени защищены от действия протеаз.
Концепция диализа была представлена в 1861 году шотландским химиком Томасом Грэмом. Он использовал эту технику для разделения растворенных веществ сахарозы (малая молекула) и гуммиарабика (большая молекула) в водном растворе. Он назвал диффундирующие растворенные вещества кристаллоидами и те, которые не проходят через мембрану коллоидами.
Исходя из этой концепции, диализ можно определить как процесс самопроизвольного отделения взвешенных коллоидных частиц от растворенных ионов или молекул малых размеров через полупроницаемую мембрану. Чаще всего диализные мембраны изготавливаются из целлюлозы, модифицированной целлюлозы или синтетического полимера (ацетата целлюлозы или нитроцеллюлозы).
СОДЕРЖАНИЕ
Принципы диализа
Из-за размера пор мембраны большие молекулы в образце не могут проходить через мембрану, тем самым ограничивая их диффузию из камеры для образца. Напротив, небольшие молекулы будут свободно диффундировать через мембрану и достичь равновесия по всему объему раствора, тем самым изменяя общую концентрацию этих молекул в образце и диализате (см. Диализный рисунок справа). После достижения равновесия конечная концентрация молекул зависит от объемов используемых растворов, и если уравновешенный диализат заменен (или заменен) свежим диализатом (см. Процедуру ниже), диффузия еще больше снизит концентрацию малых молекул. в образце.
Диализ можно использовать для введения или удаления небольших молекул из образца, поскольку небольшие молекулы свободно перемещаются через мембрану в обоих направлениях. Это делает диализ полезным методом для множества применений. См. Раздел « Трубки для диализа» для получения дополнительной информации об истории, свойствах и производстве полупроницаемых мембран, используемых для диализа.
Наконец, ультрафильтрация, которая представляет собой конвективный поток воды и растворенных веществ вниз по градиенту давления, вызванному гидростатическими или осмотическими силами. При диализе ультрафильтрация удаляет из образца молекулы отходов и лишние жидкости.
Диффузионный диализ
Электродиализ
Доннан Диализ
Обратный электродиализ
Электро-электродиализ
Процедура диализа
Оборудование
Общий протокол
Типичная процедура диализа образцов белка выглядит следующим образом:
Общий объем образца и диализата определяет конечную равновесную концентрацию малых молекул по обе стороны мембраны. Используя соответствующий объем диализата и многократные замены буфера, можно снизить концентрацию мелких загрязняющих веществ в образце до приемлемого или незначительного уровня. Например, при диализе 1 мл образца против 200 мл диализата концентрация нежелательных диализируемых веществ будет уменьшена в 200 раз при достижении равновесия. После двух дополнительных замен буфера по 200 мл каждая, уровень загрязнения в образце будет снижен в 8 x 10 6 (200 x 200 x 200) раз.
Оптимизация переменных и протокола
Хотя диализ образца относительно прост, универсальная процедура диализа для всех применений не может быть предоставлена из-за следующих переменных:
Кроме того, конечная точка диализа в некоторой степени субъективна и зависит от области применения. Следовательно, общая процедура может потребовать оптимизации.
Мембраны для диализа и MWCO
Диализные мембраны производятся и характеризуются в соответствии с предельными значениями молекулярной массы (MWCO). В то время как мембраны с MWCO в диапазоне от 1 до 1000000 кДа коммерчески доступны, наиболее часто используются мембраны с MWCO около 10 кДа. MWCO мембраны является результатом количества и среднего размера пор, созданных во время изготовления диализной мембраны. MWCO обычно относится к наименьшей средней молекулярной массе стандартной молекулы, которая не будет эффективно диффундировать через мембрану во время расширенного диализа. Таким образом, диализная мембрана с молекулярной массой 10 кДа обычно удерживает более 90% белка с молекулярной массой не менее 10 кДа.
Важно отметить, что MWCO мембраны не является четко определенной величиной. Молекулы с массой, близкой к пределу MWCO мембраны, будут диффундировать через мембрану медленнее, чем молекулы, значительно меньшие, чем MWCO. Чтобы молекула могла быстро диффундировать через мембрану, она обычно должна быть по крайней мере в 20-50 раз меньше, чем рейтинг MWCO мембраны. Следовательно, нецелесообразно отделять белок 30 кДа от белка 10 кДа с помощью диализа через диализную мембрану, рассчитанную на 20 кДа.
Диализные мембраны для лабораторного использования обычно изготавливаются из пленки регенерированной целлюлозы или сложных эфиров целлюлозы. См. Ссылку для обзора целлюлозных мембран и производства.
Форматы лабораторного диализа
Широкий выбор диализных устройств (или диализаторов) доступен от нескольких поставщиков. Диализаторы предназначены для определенных диапазонов объемов пробы и обеспечивают большую безопасность пробы, а также повышенную простоту использования и производительности при проведении диализных экспериментов с использованием трубок. Наиболее распространенными предварительно отформатированными диализаторами являются линейки продуктов Slide-A-Lyzer, Float-A-Lyzer и Pur-A-lyzer / D-Tube / GeBAflex Dialyzers.
Поставщики
Приложения
Диализ имеет широкий спектр применения. Их можно разделить на две категории в зависимости от типа используемого диализа.
Диффузионный диализ
Некоторые применения диффузионного диализа объясняются ниже.
Электродиализ
Некоторые применения электродиализа объясняются ниже.
Преимущества и недостатки диализа
Диализ имеет как преимущества, так и недостатки. Следуя структуре предыдущего раздела, обсуждаются плюсы и минусы в зависимости от типа используемого диализа. Преимущества и недостатки как диффузионного диализа, так и электродиализа описаны ниже.
Диффузионный диализ
Электродиализ
Основным недостатком электродиализа является ограничение плотности тока, процесс должен проводиться при более низкой плотности тока, чем максимально допустимая. Дело в том, что при приложении определенного напряжения диффузия ионов через мембрану не является линейной, что приводит к диссоциации воды, что снижает эффективность работы. Другой аспект, который следует учитывать, заключается в том, что, хотя для работы требуется низкая энергия, чем выше концентрация соли в исходном сырье, тем выше будет необходимая энергия. Наконец, в случае некоторых продуктов необходимо учитывать, что электродиализ не удаляет микроорганизмы и органические загрязнители, поэтому необходима дополнительная обработка.
Диализ белков — инновационные устройства Thermo Fisher Scientific
Диализ — отделение низкомолекулярных примесей или изменение солевого состава среды за счёт низкомолекулярного растворителя и полунепроницаемой мембраны. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе. Диализ используется для широкого спектра применений: обессоливание, буферный обмен, удаление меченых реагентов, исследования связывания лекарств, рост и кормление клеток, очистка вирусов и обработка крови.
Продукция Thermo Fisher Scientific (Pierce) для диализа даёт возможность диализовать образцы в широком диапазоне объёмов от 10 мкл до 250 мл. Специальные диализные ёмкости не требуют применения клипс и других дополнительных приспособлений, что позволяет сэкономить время и избегать потерь или загрязнений образца.
Продукты серии Slide-A-Lyzer снабжены MWCO-мембраной (molecular weight cut-off, отсечка по молекулярной массе), предназначенной для диализа молекул с молекулярным весом до 2; 3,5; 7; 10 или 20 кДа. Характеристика разделения, определяемая диапазоном размеров пор диализной мембраны, чаще всего называется молекулярной массой (MWCO) мембраны. Традиционно MWCO мембраны относятся к наименьшей средней молекулярной массе стандартной молекулы, которая не будет эффективно диффундировать через мембрану. Как правило, самая маленькая глобулярная макромолекула (в дальтонах), которая удерживается более чем на 90% при расширенном диализе (в течение ночи), определяет номинальный MWCO. Таким образом, диализная мембрана с 10K MWCO обычно будет содержать белки, имеющие молекулярную массу по меньшей мере 10 кДа.
Ёмкости для диализа используют при работе с небольшим количеством образца, в диапазоне от 10 мкл до 2 мл. Кассеты для диализа необходимы, когда количество образца составляет от 0,5 мл до 30 мл. При больших объёмах, от 150 мл до 250 мл, используют колбы для диализа. Планшеты для диализа предназначены для обработки от 1 до 96 образцов объёмом от 10 до 100 мкл. Для образцов в диапазоне от 2 мл до 9,6 мл используют мешки для диализа.
Хроническая почечная недостаточность – это состояние, при котором выделительная система человека перестаёт выполнять физиологические функции. Из-за гибели нефронов почки утрачивают способность поддерживать гомеостаз – постоянство внутренней среды. При хронической почечной недостаточности у мужчин и у женщин продукты распада нутриентов полностью не выводятся из организма, что влечет за собой тяжелые осложнения. В НИИ урологии и интервенционной радиологии имени Н.А. Лопаткина — филиале ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России применяются все современные методы лечения данного заболевания.
Хроническая почечная недостаточность (ХПН) является обычно исходом заболеваний, приводящих к прогрессирующей потере нефронов:
Причины ХПН
Дисфункции мочевыделительной системы могут провоцировать другие острые и хронические патологии:
Хроническая почечная недостаточность также развивается по таким причинам:
Стадии хронической почечной недостаточности
В своем развитии почечная недостаточность проходит 4 стадии:
Хроническая почечная недостаточность по разным причинам может развиваться в течение нескольких месяцев и даже лет. Поэтому рекомендуется обращать внимание на первые тревожные «звоночки», чтобы не допустить развитие осложнений.
Прогрессирование хронической почечной недостаточности влечет за собой развитие следующих симптомов:
Хроническая почечная недостаточность на последней стадии сопровождается такими симптомами, как одышка, частое сердцебиение, отеки, глубокое шумное дыхание, судороги в конечностях. Ярким признаком прогрессирования заболевания считается уменьшение суточного объема мочи до 200 мл. Стул становится зловонным, изо рта появляется неприятный запах.
Вероятные осложнения при ХПН
При отсутствии своевременной диагностики и грамотной терапии хроническая почечная недостаточность провоцирует полиорганные нарушения со стороны:
Без соответствующего лечения хроническая почечная недостаточность может закончиться летальным исходом из-за уремической комы или сердечно-сосудистых нарушений у женщин и у мужчин.
Диагностика хронической почечной недостаточности
Ключевую роль в диагностике хронической почечной недостаточности играют лабораторные исследования. Уже при первых признаках заболевания могут наблюдаться изменения в составе крови – повышение уровня креатинина, мочевой кислоты и щелочной фосфатазы. При этом снижается уровень гемоглобина, тромбоцитов, альбумина и калия, уменьшаются показатели вязкости крови (гематокрита). Важный симптом хронической почечной недостаточности – существенное снижение плотности мочи, повышение уровня эритроцитов, лейкоцитов, белка и цилиндров.
Комплексная диагностика включает также липидограмму – исследование всего спектра жировых соединений в составе крови. Особое внимание уделяется показателям триглицеридов и холестерола.
Поставить точный диагноз «хроническая почечная недостаточность» помогают такие методы:
Лечение хронической почечной недостаточности
Лечение хронической почечной недостаточности направлено на достижение стойкой ремиссии, поскольку добиться абсолютного выздоровления современная медицина не способна. Но благодаря своевременной терапии удается сгладить симптоматику, отсрочить появление осложнений и существенно улучшить качество жизни пациента.
Лечение хронической почечной недостаточности должно начинаться с устранения основной причины патологии. Усилия врачей направлены на компенсацию признаков сахарного диабета, гломерулонефрита, поликистоза и других аутоиммунных нарушений. В приоритете – комплексный подход к лечению, который включает:
Большая роль отводится симптоматическому лечению, которое позволяет облегчить протекание болезни и улучшить самочувствие пациента. Больным назначают препараты, которые восполняют дефицит витамина D, контролируют артериальное давление, корректируют кислотно-щелочной баланс, борются с олигурией.
В некоторых случаях для лечения хронической почечной недостаточности показаны дробные переливания эритроцитной массы. Методика позволяет повысить уровень гемоглобина в крови, уменьшить проявления анемии, устранить последствия внутренних кровотечений. По достижении ремиссии пациентам с хронической почечной недостаточностью показано санаторно-курортное лечение.
Если консервативные методы терапии не дают ожидаемых результатов, пациенту может быть назначена трансплантация почки. Это физиологический метод заместительного лечения с использованием донорского органа. После пересадки почки проводится комбинированная иммуносупрессивная терапия, препятствующая отторжению донорской почки.
Основными способами лечения ТХПН повсеместно признаны диализ и трансплантация почки.
Наиболее полное замещение почечной функции происходит в результате успешной трансплантации почки, а диализ замещает ее лишь частично.
Гемодиализ (ГД)
— метод внепочечного очищения крови при острой и хронической болезни почек. Во время гемодиализа происходит удаление из организма токсических продуктов обмена веществ, для уменьшения биохимических аномалий, нормализация нарушений водного, электролитного балансов и кислотно-щелочного равновесий. Очищение крови производится путем снижения концентрации в ней вредных веществ. В зависимости от метода гемодиализа, это достигается различными путями. Под гемодиализом понимают процедуру фильтрации плазмы крови с помощью полупроницаемой мембраны, через поры которой проходят молекулы с небольшой молекулярной массой, а крупные молекулы белков остаются в плазме, которая затем возвращается в кровоток пациента.
Назначение:
1.Обеспечение компенсаторной функции почек, фильтрация крови от токсических соединений и конечных продуктов метаболизма. Гемодиализ при хронической недостаточности проводят трижды за неделю, но нарастание интоксикации – основание для более частого проведения процедуры. При крайне тяжести, диализ выполняют до конца жизни, или пока не трансплантируют здоровую почку. 2. Почечная недостаточность, как осложнение острого гломерулонефрита, пиелонефрита. Цель назначения процедуры – вывести излишек жидкости из организма, устранить отеки, эвакуировать продукты токсического свойства. 3. Дисбаланс электролитов в крови. Указанное состояние происходит вследствие массивных ожогов, перитонита, обезвоживания, лихорадочных явлений. Гемодиализ позволяет вывести чрезмерную концентрацию ионов одного вида, заместив их другими. Также показанием для рассматриваемой процедуры выступает избыток жидкости в организме, что приводит к отеку оболочек головного мозга, сердца, легких. Диализ помогает сократить отечность и снизить уровень артериального давления. Процедура гемодиализа проводится на АИП с помощью одноразовых расходных материалов, к которым относятся диализаторы, кровопроводящие магистрали, фистульные иглы, катетеры, диализные концентраты.
Аппарат для гемодиализа представляет автоматизированное высокопоточное устройство, с помощью которого достигается максимально качественная очистка жидкостей. Многочисленные датчики следят за процессом и контролируют все его показатели. Организм, подключенный к диализатору, получает необходимую качественную очищенную кровь. Диализ позволяет лишь частично заменить работу почек, так как не способен обеспечить ее эндокринные функции. Но и этого бывает достаточно, чтобы улучшить состояние больного.
Показания к началу Заместительной почечной терапии – гемодиализу:
В дневном стационаре – отделении гемодиализа вам помогут:
Процедура проводится 3 раза в неделю. Длительность ее составляет от 240 мин до 270 мин.
В дневном стационаре проводятся:
Отделение развернуто на 15 диализных мест. Парк аппаратов «Искусственная почка» насчитывает 15 диализных мест, работающих в 4 смены круглосуточно. Для диализа используются диализаторы с мембраной нового поколения (из полисульфона, благодаря высокой проницаемости такой мембраны кровь проходит глубокую очистку, и выводится больший объем токсинов, чем с обычной мембраной из целлюлозы), глюкозосодержащие концентраты диализирующей жидкости, установлена высокопроизводительная система водоочистки, качество воды которой полностью соответствует мировым стандартам. Наше отделение оборудовано пандусами, поручнями, что очень важно для пациентов с ограниченными возможностями здоровья.
В отделении гемодиализа пациенты могут получить консультативную помощь всех специалистов НИИ урологии и интервенционной радиологии имени Н.А. Лопаткина –филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Подключение к аппарату искусственной почки и регулярное прохождение процедуры позволяют продлить жизнь от 15 до 25 лет. Пациенты, отказавшиеся от данной процедуры, имеют риск летального исхода намного раньше – за считанные месяцы.
Все услуги и медицинская помощь оказывается пациентам абсолютно бесплатно в рамках ОМС.
Отделение, в котором лечат почечную недостаточность
Жители города Москвы для получения направления и прикрепления к гемодиализному центру должны пройти консультацию у главного внештатного специалиста – нефролога Департамента здравоохранения г. Москвы в консультативно-диагностическом отделении Городской клинической больницы №52.
Жители субъектов РФ могут поступить на лечение в Дневной стационар НИИ урологии и интервенционной радиологии имения Н.А. Лопаткина по направлению формы 057/у.
Платные медицинские услуги предоставляются в виде комплексной программы медицинской помощи, по желанию пациента, или гражданам, обеспечение которых бесплатными медицинскими услугами не предусмотрено законодательством Российской Федерации (гражданам иностранных государств, лицам без гражданства).
Позвоните нам сегодня, чтобы мы смогли Вам помочь!
